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1、 汕头大学硕士学位论文 郭玲玲：凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基变体的研究 I 摘 要 对虾血蓝蛋白是近年来在对虾等无脊椎动物体内新发现的一种罕见的多功能蛋白，但迄今为止，其功能多样性的分子机制尚不是很清楚。可喜的是，本课题组前期研究发现对虾血蓝蛋白在核酸、蛋白质和蛋白质后修饰等不同水平具有明显的分子多态性，其可能是导致血蓝蛋白具有功能多样性的分子机制之一，然而这些 探索 还不够深入，尤其是我们最近通过生物信息学研究发现凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基可能还存在多种变体序列。为此，我们进一步对血蓝蛋白大亚基可能存在的变体及其核酸序列、免疫学功能等进行了深入 、系统的研究，所获主要研究结果如下： 1、对虾血蓝蛋
2、白大亚基变体的预测、确定及其进化关系分析 依据南卡罗莱纳医学院网站（ http:/www.marinegenomics.org/ organisms/）凡纳滨对虾EST 数据库，采用序列比对发现， 2478 条对虾血蓝蛋白大亚基（命名为 HcL） EST 序列中存在 42 条与野生型 HcL 序列同源性为 89-93 %的序列，根据其核酸序列 差异的大小， 可分为 10 种不同的类型。同时，根据这些 HcL EST 氨基酸差异序列高频出现区间，设计简并引物，通过 PCR 扩增与测序分析，发现 138 条序列中存在 5 条与野生型 HcL 碱基差异率为 7-9 的序列。最后，根据这些差异序列与野
3、生型 HcL 序列差异的大小，选择 3 种主要类型的变体即 HcLV1、 HcLV2、 HcLV3 和 该 3 种变体的共有序列片段 HcLVt 进行深入研究。 在确定对虾血蓝蛋白大亚基确实存在变体的基础之上，进一步以 HcLV1 为研究对象探索同一变体类型不同序列的进化关系，首先按常规方法对 HcLV1 进行 PCR 扩增与克隆，继而任意选 取 69 个 HcLV1 阳性克隆进行序列测定与序列比对，结果发现， HcLV1 可以进一步分为 10 种类型。进化分析显示， HcLV1 10 种类型的序列可由两条祖先序列（ HcLV1-01，HcLV1-02）通过基因重组和碱基突变演化而来。 由此说
4、明，对虾血蓝蛋白大亚基存在多种变体序列，且这些变体之间 存在着进化关系。 2、 2 种 HcL 变体全长 cDNA 的克隆及序列分析 基于已获得的 HcLV1、 HcLV3 部分序列，采取 RACE 技术，克隆 HcLV1、 HcLV3 全序列，发现 HcLV1、 HcLV3 cDNA 全长分别为 2254、 2127 bp，编码 676、 672 个氨基酸。经 BLAST 比对， HcLV1、 HcLV3 氨基酸序列与 HcL 序列存在 86、 90 的相似性。两者均具有血蓝蛋白的典型结构，包括铜离子结合区域，保守 His 位点和 Ig-like 区等。该结果进一步证实了对虾血蓝蛋白变体的存
5、在，为深入了解对虾血蓝蛋白免疫机制奠定了良好的基础。 汕头大学硕士学位论文 郭玲玲：凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基变体的研究 II 3、病原胁迫对 3 种 HcL 变体 mRNA 表达水平的影响 RT-PCR 分析发现 3 种 HcL 变体 mRNA 表达存在一定的组织特异性，其中 HcLV2、HcLVt 在本研究所涉及的 10 种对虾组织（肌肉、胃、后肠、心脏、 肠、鳃、淋巴腺、肝脏、脑和血细胞）中均有表达； HcLV3 在除胃组织以外的 9 种组织中显著表达； HcLV1 在肌肉、胃、后肠和肝胰腺等 4 种组织中 缺失 表达。 继而，选用副溶血弧菌，溶藻酸弧菌，河弧菌， 大肠杆菌， 乙型链球菌
6、和 金黄色葡萄球菌等 6 种病原菌胁迫凡纳滨对虾（分别将以上六种病原菌缩写为 VP、 VA、 VF、 EC、BS 和 SA ），运用 SQ-PCR 分析显示， HcLV1 对六种病原菌的胁迫表现出较明显的表达变化； HcLV2 表达主要受 VP、 VF、 BS 和 EC 胁迫的影响； HcLV3 表达变化主要与 VP、 VF和 EC 胁迫有关； HcLVt 则在病原胁迫后变化不显著。 最后，进一步采用 Real-time PCR 分析病原胁迫对 HcLV1、 HcLV2 表达变化的影响。结果发现， HcLV1 在上述六种病原菌胁迫对虾 48、 48、 9、 48、 48 和 24 h 后出现较
7、高的表达量，分别为对照组的 9.5、 6.2、 11、 8.5、 8.8 和 1.9 倍； HcLV2 在除大肠杆菌之外的五种菌胁迫对虾 9-48h 后，与对照组相比，表达量上升 3.1-22 倍。由此说明，对虾血蓝蛋白大亚基变体与对虾免疫防御密切相关，且不同变体对不同病原菌存在响应程度的差异。 4、 1 种 HcL 变体的原核表达及 其免疫学功能研究 在上述研究基础之上，进一步选取与病原胁迫免疫相关性最显著的 HcLV1 进行原核表达与免疫学活性分析，结果发现， HcLV1 重组表达蛋白分子量为 93.3 kDa， 与预期大小一致， 其对副溶血弧菌等 6 种菌具有明显的凝集活性。 rHcLV
8、1 对 副溶血弧菌、溶藻酸弧菌和乙型链球菌 的凝集活性最高，为 rHcL 的 16 倍，其次是对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的凝集活性，均为为 rHcL 的 8 倍，对河弧菌的凝集活性相对较低，仅为 rHcL 的 4 倍。 说明，对虾血蓝蛋白变体确实具有明显的免疫学功能。 综上所述，本研究主要发现凡纳滨 对虾体内存在 3 种血蓝蛋白大亚基变体，其与对虾抵御不同病原微生物密切相关。所获研究结果，对丰富对虾血蓝蛋白的分子多态性研究，深入揭示血蓝蛋白功能多样性的分子机制，阐明对虾免疫防御机制等具有重要的意义 。 同时，为选育抗逆优良对虾品种、建立对虾病害的免疫学防治方法等提供了良好的科学依据，促进对虾养
9、殖业的健康、持续发展。 关键词 ：对虾，血蓝蛋白，变体，病原菌，免疫 汕头大学硕士学位论文 郭玲玲：凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基变体的研究 III Abstract It is demonstrated that hemocyanin is a rare multifunctional protein newly reported in shrimp and other invertebrate recently. Whereas the mechanism of its multifunction is still not clear. Based on our previous report
10、that hemocyanin mainly displayed diversity in nucleotide, protein and protein modification levels, which could be correlated with its diverse function. Interestingly, we lately found that there might exist some variants of hemocyanin subunit with higher molecular weight (HcL) in shrimp Litopenaeus v
11、annamei by bioinformation on line. Thus it is urgent to further investigate the potential hemocyanin variants and their nucleotide sequence and immune activities. The main results were shown as follows: 1. The prediction and determination of variants of shrimp L.vannamei hemocyanin subunit with high
12、er molecular weight, and analysis of their evolutionary relationship. According to the EST database established by South Carolina College of Medicine (http:/www.marinegenomics.org/ organisms/), we obtained 42 variants with the homology of 89-93 % compared with wild type HcL out of 2478 sequences. Th
13、ose can be divided into 10 types considering their nucleotide differences. Furthermore, the variants were amplified by degenerate primers, which were designed according to the variants with high-frequency difference in nucleotide, using the methods of semi-quantative PCR and sequencing analysis. The
14、 results indicated that there existed 5 variants with homology 7-9 compared with HcL out of 138 sequences of L. vannamei. Finally, 3 types of hemocyanin variants, namely HcLV1, HcLV2, HcLV3 and one common sequence fragment namely HcLVt, were selected to further investigate. Combined with the above f
15、indings, 69 positive clones of HcLV1 through PCR and DNA sequencing strateges were selected to explore the evolutionary relationship among the sequences of HcLV1. The comparative analysis of the 69 clones of HcLV1 showed that they can be divided into 10 types. Further evidences indicated that the 10
16、 types were evolved from two ancestor sequences caused by gene recombination and mutation. Thus, we conclueded that L. vannamei can express a variety of HcL variants, and they displayed evolutionary relationship with each other. 2. Cloning and sequence analysis of two HcL variants of full-length cDNA 汕头大学硕士学位论文
