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1、1胎盘组织中 Human AnnexinV 的表达及与 HBV感染的关系作者：张润驹，岳亚飞，李淑红，石紫云，叶峰，归巧娣，石磊 【关键词】 乙型肝炎病毒(HBV)摘要：目的 观察 Human AnnexinV(HAV)在胎盘组织中的表达，并探讨其在乙型肝炎病毒(HBV)感染胎盘中的可能作用。方法 用免疫荧光染色法检测早孕绒毛，中孕和足月胎盘绒毛中 HAV 的表达；用免疫荧光双重染色法观察 HBV 感染的胎盘组织 HBsAg 和 HAV的分布及相互关系。结果 所有的标本绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、毛细血管内皮细胞都有 HAV 的存在。HBV 感染的胎盘绒毛中只要是 HBsAg 阳性的部位同时
2、一定有 HAV 的表达，阳性信号存在于滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞中。结论 HAV 可能作为 HBsAg 的特异性受体介导了 HBV 与胎盘组织各层细胞的粘附、内化等过程并最终导致了 HBV 对胎盘的感染。关键词：胎盘；病毒受体；人膜联蛋白(HAV) ；乙型肝炎病毒(HBV)Expression of Human Annexin in placenta and its 2effects on placenta infected by HBVABSTRACT: Objective To investigate the expression of Human Annexin V(
3、HAV) in placenta and to explore the possible role of it in HBV infected placenta. Methods HAV was detected in placentas that had been proved infected with HBV with immunofluorescence assays and the doublelabel immunofluorescence assays were used to detect HBsAg and HAV in the same placenta. Confocal
4、 laser scanning microscope was also used to observe the result. Results HAV was expressed on early period, metaphase and term villi. It was expressed on trophoblastic cell, interstitial cell and endothelium cell of interstitial blood vessels of villi. The result had no relation with the infection of
5、 HBV and the time of pregnancy. The doublelabel immunofluorescence assays showed the positive area of HBsAg in placentas accorded with the area of HAV. Conclusion HAV mediated HBV into cells of placenta as specific receptor and resulted in infection.KEY WORDS: placenta; viral receptor; human annexin
6、 V(HAV); hepatitis B virus(HBV)3我国为乙肝高感染区，HBsAg 携带者高达 1.2 亿，其中 50%以上为母婴传播所致。而 HBV 宫内感染是母婴传播的重要途径，感染率可高达 40%以上1。目前普遍认为 HBV 宫内感染主要经胎盘感染而致，即孕妇绒毛间隙血中的 HBV 感染绒毛滋养层细胞、 绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞后感染胎儿2，但具体机理现仍不清楚。HBV 感染肝脏的研究表明，HBV 也同其他的病毒一样 ，首先通过病毒外膜蛋白识别肝脏细胞质膜上的受体3，和靶细胞上的受体结合，附着于细胞表面，在病毒受体的介导下，进入细胞进行复制。有研究发现人膜联蛋白 V
7、(Human Annexin V, HAV)是肝细胞膜上与 HBV 感染有关的受体4。并且在胎盘组织中也检测到HAV5，那么 HBV 感染胎盘各类细胞是否也与 HAV 有关？为此，我们对正常的不同孕期胎盘和足月 HBV 感染的胎盘中 HAV 及HBsAg 表达应用免疫荧光双标记技术进行检测，以了解其分布和相互关系，并探讨 HAV 在 HBV 感染胎盘中的可能作用。1 材料与方法1.1 材料 2003 年 3 月至 2004 年 3 月，收集在西安交通大学第一医院住院分娩的产前检查及复查血清中 HBsAg 阳性(其中大三阳 12 例，小三阳 15 例) 孕妇足月分娩胎盘 27 例。同时随机收集3
8、 例 HBV 血清标志物阴性的正常足月胎盘；另外取人工流产及住院治疗性中期引产的 HBV 血清标志物阴性的孕妇绒毛和胎盘各 3 例。4鼠抗人乙肝病毒表面抗原(HBsAg)单克隆抗体(一抗)、FITC 标记兔抗山羊 IgG(二抗)、罗丹明标记山羊抗小鼠 IgG(二抗)购于北京中山生物技术有限公司。山羊抗人膜联蛋白 V(Annexin V)多克隆抗体(一抗) ，购于 Santa Cruz 生物技术公司。1.2 方法 取新鲜全层胎盘组织，大小为2cm1cm0.5cm，生理盐水洗去沾染的血液 (末次洗后上清用PCR 及 ELISA 未检测出 HBV 标志物)， 40g/L 多聚甲醛固定24h；绒毛则直
9、接用生理盐水冲洗后以 40g/L 多聚甲醛固定，石蜡包埋，4m 连续切片备用。1.2.1 Human Annexin V 免疫荧光染色 常规脱蜡至水；H2O2 37 15min 封闭内源性过氧化物酶；正常兔血清 37 30min 封闭非特异性蛋白； 滴加 150 稀释的山羊抗人膜联蛋白V 多克隆抗体，4过夜； 滴加 1100 稀释的 FITC 标记的兔抗山羊 IgG，37 1h，以上各步间均用 PBS 冲洗，5min3 次；缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)上观察并拍照。用于 FITC 的激发波长为 495nm。用 PBS 取代山羊抗人膜联蛋白 V 多克隆抗体作为空
10、白对照。1.2.2 HBsAg 和 Human Annexin V 免疫荧光双标染色 经SP 免疫组化法检测出 22 例胎盘 HBsAg 阳性，用免疫荧光双标染5色观察胎盘组织中 HBsAg 和 Human Annexin V 的分布。切片常规脱蜡至水；加入尿素，室温 30min 后，蒸馏水洗 1 次；加 150 稀释的鼠抗人乙肝病毒表面抗原单克隆抗体和 150 稀释的山羊抗人膜联蛋白 V 多克隆抗体，4 过夜； 滴加 1100 稀释的 TRITC 标记的山羊抗鼠 IgG 和 1100 稀释的 FITC 标记的兔抗山羊 IgG，37 1h；无荧光缓冲甘油封片。以上各步间均为PBS 洗 5min
11、3 次。在型号为 LeiCaTCS SP2 的激光共聚焦扫描显微镜(LSCM)上观察并拍照。FITC 的激发波长为 495nm，TRITC 的激发波长为 546nm。1.3 结果判断标准 HBsAg 阳性部位发红色荧光，Human Annexin V 阳性部位发绿色荧光，HBsAg 和 Human Annexin V的重叠处发黄色荧光。2 结果2.1 不同孕周胎盘 Human Annexin V 的表达和分布 应用免疫荧光染色方法检测血清 HBsAg 阴性早孕绒毛 3 例、中期引产胎盘 3 例、足月胎盘 3 例和血清 HBsAg 阳性的足月孕妇娩出的胎盘3 例 Human Annexin V
12、的表达、分布。发现无论妊娠时间长短、感染 HBV 与否，所有标本的绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内血管内皮细胞都有 Human Annexin V 的表达(图 1)。空白对照未6显示阳性信号。图 1 免疫荧光染色绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内毛细血管内皮细胞 HAV 阳性表达呈绿色荧光（略）Fig.1 Immunofluorescence staning of HAV in trophoblastic cells, villous mesenchymal cells and villous capillary endothelial cells, HAV positive is in
13、 green (1040)2.2 HBsAg 和 Human Annexin V 在胎盘的分布 对 HBsAg阳性的 22 例胎盘组织采用免疫荧光双标染色方法检测 HBsAg 和Human Annexin V 在胎盘分布情况。发现胎盘绒毛中HBsAg、Human Annexin V 和 HBsAg+Human Annexin 均有阳性表达，阳性信号存在于滋养层细胞、绒毛间质细胞、绒毛毛细血管内皮细胞(图 2)。空白对照未显示阳性信号。图 2 免疫荧光双标染色检测绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内毛细血管内皮细胞 HAV 和 HBsAg 表达（略）Fig.2 The detection of
14、HAV and HBsAg in trophoblastic cells, villous mesenchymal cells and villous capillary endothelial cells by double labeling technique of immunofluorescence(1040). 7a: HAV positive is in green; b: HBsAg positive is in red, overlaped with HAV; c: HAV and HBsAg positive at the same site is in yellow3 讨论
15、HBV 属嗜肝病毒，但具有一定的泛嗜性，可感染多种组织，如心、肾等。已证实 HBV 与细胞膜上相应受体结合是其感染细胞的关键3，HAV 是近年被作为 HBV 受体研究的热点之一。研究认为HAV 可能作为 HBV 的细胞受体与病毒内吞及摄入直接相关6 。并且多项研究显示 HBV 感染和复制仅发生于含 HAV 的组织和细胞中。体外实验中发现表达 HAV 的鼠肝细胞可特异性结合 SHBsAg，并产生 HBV 复制性感染7；不表达 HAV 的大鼠肝癌细胞 FTO2B 转染 HAV 基因后，能感染 HBV，复制并表达 HBsAg 和 HBcAg，且分泌 HBVDNA 至培养细胞上清中，使上清具有再感染能
16、力8。也有研究证实在慢性肝炎患者各组织的 HBVDNA、RNA 转录体、抗原分布与 HAV 分布一致9。以上研究结果均说明 HAV 与 HBV 感染组织相关。虽然众多学者已证实 HBV 可感染胎盘各层细胞，但感染机制尚不明确。本研究结果证实在不同孕期(早、中、晚期)、不同 HBV 感染状态(HBsAg 阳性或阴性)的绒毛组织滋养层细胞、绒毛间质细胞、8间质内毛细血管内皮细胞上均有 HAV 的表达。对 HBsAg 阳性胎盘的免疫荧光双重染色检测结果则显示胎盘绒毛组织中 HBsAg 和HAV 的表达部位是一致的，它们的阳性信号出现在绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、间质内血管内皮细胞。该结果进一步证实 HAV 可能作为 HBsAg 的特异性受体介导了 HBV 与胎盘各层细胞的粘附、内化等过程，并且在多种因素的参与下完成了病毒对胎盘的感染。但是 HBV 感染胎盘是一个复杂过程，可能涉及多种病毒吸附蛋白及多
