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1、1结直肠癌中抑癌基因 ING1 的表达研究作者：张森 韦建宝 周永淳 陈利生 【摘要 】 目的 探讨抑癌基因 ING1 及其蛋白 p33/ING1 在结直肠癌中的表达。方法 用 RTPCR检测 35 例散发性结直肠癌中ING1 mRNA 的表达水平，并应用 SP法检测 60 例散发性结直肠癌及正常黏膜组织中 p33/ING1 蛋白的表达。结果 结直肠癌组织、正常黏膜组织中 p33/ING1 蛋白阳性表达率分别为 43.3%(26/60)、100%(60/60)，两者比较差异有统计学意义(P0.01)。p33/ING1 在无淋巴结转移组及淋巴结转移组中的阳性表达率分别为 57.6%(19/33)
2、、25.9%(7/27) ，两者比较差异有统计学意义(P0.05)。在 Dukes A、B 期和 Dukes C、D 期患者癌组织中p33/ING1 的阳性表达率分别为 56.7%(17/30)、30.0%(9/30)，两者比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 ING1 及 p33/ING1 蛋白的低表达与散发性结直肠癌发生、发展密切相关，临床分期越差者表达水平越低。 【关键词】 抑癌基因 ING1 结肠肿瘤 直肠肿瘤【Abstract】 Objective To discuss the expression of tumor 2suppressor gene ING1 and its p
3、rotein p33/ING1 in development of sporadic colorectal carcinoma. Methods Reverse transcriptionpolymerase chain reaction was used to detect mRNA expression level of ING1 in 35 cases with sporadic colorectal carcinoma and streptomycete avidinperoxidase immunohistochemistry to measure expression level
4、of protein p33/ING1 in colorectal cancerous tissues and normal mucous tissues from 60 cases with sporadic colorectal carcinoma. Results Expression level of p33/ING1 mRNA in colorectal cancerous tissues was more significantly decreased than that in normal mucous tissues. Expression level of p33/ING1
5、mRNA in the tumors of patients at stage of Dukes A and B was significantly higher than that in patients at stage of Dukes C and D, as indicated that the expression decreased with poor clinical stage. Positive expression rates of p33/ING1 in colorectal cancerous tissues and normal mucous tissues were
6、 43.3% (26/60) and 100% (60/60), respectively, with significant statistical difference (P0.01). Positive expression rates of p33/ING1 in groups with or without lymph node metastasis were 25.9% (7/27) and 57.6% (19/33) respectively (P0.05). Positive expression rates of p33/ING1 in patients at stage o
7、f Dukes A, B and at 3stage of Dukes C and D were 56.7% (17/30) and 30.0% (9/30) respectively (P10 cm 的正常黏膜组织) 。其中男 28 例，女 32 例，年龄 2682 岁，平均 58.5 岁。管状、乳头状腺癌 45例，黏液腺癌 15 例。按 Dukes 临床分期， A、B、C、D 期各 15例，有淋巴结转移 27 例。标本经 10%甲醛液固定，常规石蜡包埋，5 m连续切片，HE 染色。前期(2002 年 12 月至 2003 年 3 月)35例行突变检测患者中，男 20 例，女 15 例，年龄
8、 2579 岁，中位年龄为 59 岁。结肠癌 16 例，直肠癌 19 例。其中腺癌 32 例，黏液腺癌 3 例。Edmondson 分级：级 5 例，级 22 例，级 8例。Dukes 分期：A 期 2 例，B 期 15 例，C 期 13 例，D 期 5 例。收集的肿瘤组织、正常黏膜组织(距癌灶 10 cm 以上)放入液氮迅速冷冻，然后在-80 中冻存备用。张森，等. 结直肠癌中抑癌基因 ING1 的表达研究 1.2 ING1 mRNA 表达测定方法RNA 和 DNA 的抽提：用一步法(Invitrogen 公司的 TRIZOL 试剂)提取组织中的总 RNA，-80 冻存备用。按柱式基因组 D
9、NA 抽提法(加拿大 BBI 公司 EZ Spin Column Genomic DNA Isolation 5Kit BS424)提取基因组 DNA，-20 冻存备用。RTPCR：首先用 Dnase (宝生物工程有限公司)消化总 RNA中的痕量 DNA，然后按逆转录试剂盒(MBI 公司)方法用 Oligo(dT)18 为引物将总 RNA 中的 mRNA 反转录成 cDNA，最后将 cDNA为模板作 PCR 扩增目的片段(引物设计均为跨内含子)和内参片段(引物序列见表 1)。PCR 反应体系总体积为 20 l，Taq 酶、10Buffur 和 dNTP Mixture 均为宝生物工程 (大连)
10、 有限公司产品，首先加目的片段引物，按照 94 1 min，62 1 min，72 1 min 进行 10 次循环之后，在同一反应管加内参照引物再进行 22 次循环，所得的 PCR 产物在 2%的琼脂糖凝胶(1TAE 电泳缓冲液)电泳，用凝胶电泳成像分析系统(BioRad Gel DOC 2000)测算出目的片段与内参片段条带的吸光度比值。表 1 RTPCR各引物对序列1.3 p33/ING1 免疫组化测定方法p33/ING1 多克隆抗体，购自 Candan Stressgen 公司。p53 单克隆抗体及免疫组化 SP试剂盒，购自北京中山公司。柠檬酸缓冲液高温高压法修复抗原，p33/ING1
11、抗体工作浓度：1150；p53抗体工作浓度：1250。阳性对照：Canada Stressgen 公司提供p33/ING1 蛋白染色阳性乳腺癌组织切片及北京中山公司提供 p53染色阳性胃癌组织切片。阴性对照：p33/ING1 及 p53 蛋白染色阴6性肛管腺瘤切片。PBS 代替一抗作空白对照。结果判断标准：p33/ING1 染色阳性主要定位于细胞核，偶见于细胞质。采用量化积分法表示 p33/ING1 的表达，每张切片的阳性细胞比例及着色深浅进行标记。根据阳性细胞数分为 5 个等级：75%；根据染色强度用分值标记 1，2 ，3。以阳性细胞数分值与染色强度分值的乘积作为每一例的积分，积分为 0 者
12、判定为阴性，积分 1者为阳性。p53 阳性染色定位于细胞核，阳性细胞数5%为阳性，5%为阴性。1.4 统计学分析采用 t 检验、 2检验和 Spearman 等级相关检验，P0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 ING1 mRNA 的表达所有的肿瘤组织和正常黏膜组织都有 p33/ING1 mRNA 表达(图 1)。肿瘤组织中的表达水平比正常黏膜组织明显降低(表 2)，两7者比较差异有统计学意义(P0.01)。表 2 癌组织与正常黏膜组织ING1 mRNA 表达水平比较 注：P 值为配对计量资料的 t 检验2.2 p33/ING1 mRNA 的表达p33/ING1 mRNA 的表达水平在
13、 Dukes C、D 期患者的肿瘤组织中比在 Dukes A、 B 期者均明显降低(表 3)，两组比较差异有统计学意义(P0.05)。表 3 Dukes A、B 与 Dukes C、D 期各 mRNA表达水平比较注：P 值为成组计量资料的 t 检验2.3 p33/ING1 在结直肠癌组织和正常黏膜组织中的表达结直肠癌组织、正常黏膜组织 p33/ING1 的阳性表达率分别为43.3%(26/60)、100%(60/60)，前者阳性表达率明显低于后者，两者比较差异有统计学意义(P0.01)。见图 2、3。2.4 结直肠癌 p33/ING1 表达与临床病理特征的关系结直肠癌组织的 p33/ING1
14、在无淋巴结转移组及淋巴结转移组癌组织中阳性表达率分别为 57.6%(19/33)及 25.9%(7/27)，两组间阳性表达率比较，差异有统计学意义(2=6.058，P=0.014)；在Dukes A、B 期阳性表达率为 56.7%(17/30)，C、D 期阳性表达率为 30.0%(9/30)，二者比较差异有统计学意义8(2=4.344，P=0.037)(表 4)。表 4 结直肠癌 p33/ING1 表达与临床病理特征的关系注：P 值为 2检验3 讨论ING1 基因是 Garkavtsev 等1 采用 cDNA 消减杂交方法并结合体内选择技术成功地克隆出的一种抑癌基因。它定位于人染色体13q3334，通过酶切分析发现 ING1 基因是由 3 个外显子和 2 个内含子组成。ING1 mRNA 至少可形成 3 种不同的剪接方式，编码3 种不同分子量的蛋白：外显子 1a 和 2 转录
