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1、1免疫印迹试验在诊断儿童幽门螺旋杆菌感染中的应用评价作者：陈运生，周少明，刘彬，孙玲玲【关键词】 免疫印迹试验摘 要 目的：评价免疫印迹试验(Western Blotting)在诊断不同年龄组及不同病理表现儿童幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染中的应用价值。方法：对 450 例有消化道症状的患儿，进行胃镜检查并取病变处胃黏膜组织行病理学检查，以及 13C尿素呼气试验(13Curea breath test,13CUBT)、血清免疫印迹试验及胃液 HPDNA PCR 检查。结果：在 4 岁 6 岁和 6 岁12 岁组患儿中，13CUBT HP 检出率明显高于免疫印迹
2、试验 (P0.01)；在 12岁18 岁组患儿中，13CUBT HP 检出率与免疫印迹试验比较差异无显著性(P0.05) 。细胞毒性基因相关蛋白(Cytotoxinassociated gene protein)阳性的 HP 感染在溃疡病组明显高于慢性胃炎组和正常组(P0.05)，慢性胃炎组 CagA(Cytotoxinassociated gene protein，CagA) 阳性 HP 显著高与正常组 (P0.05) 。结论：在12 岁以上的少年患儿中，免疫印迹试验可作为快速诊断 HP 感染的可靠手段，并且能判断出是否为产毒菌株感染。在 12 岁以下的儿童中，免疫印迹试验最好与 13CUB
3、T 联合使用。2关键词 免疫印迹试验；13C 尿素呼气试验；幽门螺旋杆菌；细胞毒性基因相关蛋白；儿童The Evaluation of Western Blotting Method for the Diagnosis of Helicobacter Pylori Infection in ChildrenAbstract ：Objective To evaluate the accuracy of the Western Blotting test in the diagnosis of Helicobacter pylori(HP) in different age groups with
4、 various gastric illnesses in children.Methods 450 children with digestive tract symptoms were tested for HP using pathological histology,13CUBT,serum western blotting and HPDNAPCR.Results In the groups with ages from 4 to 6 and 6 to12 years the detection frequency using13CUBT were significantly hig
5、her than Western blotting (P0.01).In the group with ages from 12 to 18 years,there was no difference between13CUBT and Western Blotting in detection(P0.05).Positive rate of Cag A antibody in peptic ulcer group was significantly higher than that of chronic gastritis group (P 0.05),Positive rate of Ca
6、g A antibody in chronic gastritis group was significantly higher than that of normal control 3group (P0.05).Conclusion It is rapid and dependable that the Western Blotting can be used to examine the HP antibodies in children with ages above twelve years and to determine the type of HP.Key words：West
7、ern Blotting;13Curea breath test;Helicobacter pylori;Cytotoxinassociated gene protein;Children幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,HP)与胃肠疾病的发病关系目前正在被广泛研究。HP 的致病因素包括 CagA、VacA、菌毛、尿素酶、鞭毛等，其中以 CagA、VacA 最为重要，它们是 HP 毒力的标志1 。免疫印迹试验判断出有无 HP 感染，并可区分 HP 感染的类型，在成人 HP 感染性疾病的诊断中已得到越来越多的重视。但在诊断儿童 HP 感染中的价值国内鲜见报道。本研究以 200
8、2 年10 月至 2004 年 9 月在我院消化科就诊的部分患儿为研究对象，探讨免疫印迹试验在诊断儿童 HP 感染及判断其致病性中的作用。1 资料与方法1.1 临床资料 4450 例病例均为我院 2002 年 10 月至 2004 年 9 月消化科患儿，年龄 4 岁18 岁，全部病例均有腹痛、恶心、厌食、呕吐等消化道症状，病程均在 3 个月以上。检查前 4 周内均未使用抗生素。其中 4 岁6 岁患儿 56 例，确诊 HP 感染 18 例；6 岁12 岁患儿202 例，确诊 HP 感染 123 例；12 岁18 岁患儿 192 例，确诊 HP感染 146 例。根据胃镜及病理检查结果分为：正常 6
9、4 例，确诊 HP感染 21 例；慢性胃炎及十二指肠球炎 248 例，确诊有 HP 感染161 例；胃十二指肠溃疡 138 例，确诊 HP 感染 105 例。1.2 方法1.2.1 应用 Pentax FC 24 纤维胃镜，由同一人操作。小儿慢性胃炎及胃溃疡的诊断按照小儿慢性胃炎、消化性溃疡胃镜诊断标准(试行 )进行 2 。取病变处组织 2 块，应用 10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，常规病理检查。1.2.2 HPDNA 检测(PCR 法) 留取胃液 2 ml，使用 PE5700 基因扩增仪，试剂由达安基因诊断中心提供。1.2.3 免疫印迹检查 5空腹抽取静脉血 2 ml，立即分离血清，-
10、70 冻存待查。采用深圳市伯劳特生物制品有限公司生产的 HP 免疫印迹试剂盒进行检测，严格按照操作说明书进行。显色后比对试剂盒所附的标准分子质量卡，即可测得血清样本中是否存在 CagA 的相应抗体。1.2.4 13CUBT 受检患儿空腹 4 h 以上，先口服一杯实验餐，收集零时的呼气作为空白对照。后饮用溶有 13C 标记的尿素溶液50 ml，饮用后 30 min 收集呼气，密封待查。使用 Isodiagnostika公司生产的 ISOMAX2000 设备，试剂由同一公司提供。1.2.5 HP 阳性结果判断 以三项试验(HPDNAPCR 法、免疫印迹检查、 13CUBT)中任两项阳性为确诊 HP
11、 感染的诊断标准。1.3 统计学方法 不同组别之间 HP 检出率的比较采用 2 检验。2 结果在 4 岁6 岁和 6 岁12 岁组患儿中，13CUBT HP 检出率6明显高于免疫印迹试验(P0.01) ；在 12 岁18 岁组患儿中，13CUBT HP 检出率与免疫印迹试验比较差异无显著性(P0.05)。见表 1。表 1 不同年龄组 13CUBT 与免疫印迹试验检出率的比较（略）细胞毒性基因相关蛋白阳性(CagA+)的 HP 感染在溃疡病组明显高于慢性胃炎组和正常组(P0.05) ，慢性胃炎组 CagA+HP 显著高与正常组(P0.05) 。见表 2。表 2 不同组别 CagA 阳性 HP 感
12、染率的比较（略）注：*表示正常组与溃疡组比较 P0.01；*表示胃炎组与正常组比较 P0.05；* 表示溃疡组与胃炎组比较P 0.05。3 讨论HP 于 1983 年由 Warren 和 Marshall 两位学者从胃黏膜中培养分离出以来，大量研究认为，HP 是消化性溃疡、慢性活动性胃炎等上消化道疾病的主要致病因素。HP 毒素按其分子质量可分为两种：一种为相对分子量为 128 000 的细胞毒素相关蛋白(CagA)，另一种为相对分子质量为 87 000 的空泡细胞毒素(VacA)。根据 HP分泌毒素的情况不同可以将其分为产毒菌 Tox+和非产毒菌 Tox-，而研究表明 Tox+菌其 CagA
13、蛋白几乎均为阳性，因此临床上将有CagA 表达的 HP 称为 型 HP，其致病力强，国内李庭赞等 37研究证明在成人慢性性胃炎、消化性溃疡、胃癌等疾病发生中型HP 是重要的致病因素，型为无 CagA 表达的 HP 菌株，其毒性很弱。感染后可能发病较轻或不发病。免疫印迹试验能区分 HP 的类型。其工作原理是：先将 HP 的混合抗原用聚丙烯酰胺凝胶电泳，按分子量大小不同分开，再将其转移至硝酸纤维膜上，应用酶联免疫吸附反应，受检者的血清相关抗体会与抗原结合，在相应分子量的位置上出现显色区带，据此可判断 HP 的存在并区分感染的类型。目前检测 HP 感染的方法很多，13CUBT 被认为是一种测定小儿
14、HP 感染可靠的诊断方法，具有较高的敏感性和特异性4 。本文将免疫印迹试验的 HP 检出率与 13CUBT 的结果比较，发现在12 岁以下组 13CUBT 法 HP 检出率明显高于免疫印迹试验；在 12岁18 岁组患儿中，13CUBT 法 HP 检出率与免疫印迹试验比较差异无显著性。这可能与年龄较小的患儿免疫功能较低，不能产生足够的抗体有关。证明免疫印迹试验不能单独检验年幼儿童的 HP 感染。此观点与 Oliverira 等关于酶联免疫吸附试验 (ELISA)测定 12 岁以下患儿血清 HPIgG 敏感性太低的结论一致5 。进一步研究发现细胞毒性基因相关蛋白阳性(CagA+)的 HP感染在消化
15、道溃疡病组明显高于慢性胃炎组和正常组，慢性浅表胃炎组 CagA+HP 显著高于正常组。说明 I 型 HP 感染与儿童胃炎及8消化道溃疡也有密切关系，细胞毒素可能是消化道溃疡形成的主要原因。显然，对于 12 岁以上的患儿，免疫印迹试验试验可作为快速诊断 HP 感染的方法之一，其优点在于在检出细菌的同时能作出分类，因此能有效指导临床用药。此检查特点为：非侵入性，易为患儿接受；用血少,方法简单，实验条件要求低；检测时间短，能快速出结果。但对于 12 岁以下的患儿由于其检出率有限，建议与13CUBT 联合应用。参考文献：1陈敏章，胡伏莲，周殿元, 等.幽门螺旋杆菌感染的基础与临床M.北京：中国科学技术
16、出版社 ,1997：106107.2陈洁，吴秀英. 小儿慢性胃炎、消化性溃疡胃镜诊断标准(试行 ) J. 中华儿科杂志， 1996,34(5)：296297.3李赞庭，陈志坦，孙丹莉, 等.HP 和 CagA+HP 与中国人慢性胃炎、胃腺癌、消化性溃疡的关系J.临床内科杂志，2001,18(1)：2830.94楼金吐，陈肖肖，曲一平, 等.13C 尿素呼气试验诊断儿童幽门螺旋杆菌感染的临床评估J.检验医学，2005,20(2)119120.5De Oliveira AM，Rocha GA，Queiroz DM，et al.Evaluation of enzymelinked immunosorbent assay for the diagnosis of Helicobacter pylori infection in children from different
