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1、1以 Survivin 为靶点的结直肠癌治疗研究进展摘要 Survivin 是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族的成员，可调控细胞凋亡和细胞分裂。Survivin 在绝大多数终末分化的正常成年细胞中检测不到，但在众多种类的肿瘤细胞中异常表达。近期研究发现了新的 Survivin 剪切异构体，不同的剪切异构体可能在结直肠癌的发生过程中起着不同的作用。一系列调控 Survivin 表达的实验，进一步阐明了 Survivin 在细胞凋亡过程中所起的作用，也证明了以Survivin 为靶点的结直肠癌治疗的安全性、可行性和有效性。关键词 Survivin；结直肠肿瘤，细胞凋亡；治疗结直肠癌是世界范围内最常见的
2、恶性肿瘤之一。据美国癌症协会估计，2006 年仅在美国分别有 106680 例和 41930 例结肠癌和直肠癌新发病例，我国结直肠癌的发病率亦呈逐年升高的趋势。Survivin 在肿瘤组织和正常组织之间的差异性表达及其抗凋亡的功能使其成为结直肠癌靶向治疗的理想靶点。1 Survivin 及其剪切异构体的特点Survivin 于 1997 年由 Altieri 等利用效应细胞蛋白酶受体1（effector cell protease receptor 1，EPR-1）的 cDNA 在人类2基因组文库中杂交筛选分离所获得的一种新的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptotic prot
3、ein，IAP ） 。Survivin 基因定位于染色体 17q25，全长 14.7kb，其编码链有 426 个核苷酸开放阅读框架，与 EPR-1 互补。分子量为 16.5kD 的 Survivin 蛋白含有 142氨基酸残基，结构与同族的 IAP 不同，只有一个杆状病毒 IAP 重复（baeuloviral IAP repeat，BIR）结构域，羧基端的环指结构也被一个长 螺旋所取代。正常情况下 Survivin 仅在肠黏膜隐窝的基底部表达，以保证肠道细胞的更新，维持稳态，但在绝大多数终末分化的正常成年细胞内不表达。多数肿瘤组织中会有 Survivin 异常表达，且与肿瘤的发生发展及预后有关
4、。Survivin 基因含有 4 个外显子（E1、E2、E3 和 E4） 、3 个内含子以及 3 个隐藏外显子（ 2、2b 和 3b） 。 Survivin 的 mRNA 前体经过不同的剪切，除 Survivin 外，还会产生 Survivin-Ex3、Survivin-2B、Survivin-3B1 、Survivin-224 种剪切异构体。翻译出的蛋白也因而具备不同的结构和功能，Survivin和 Survivin-3B 具备完整的 BIR 结构域，而 Survivin-Ex3 和Survivin-2 的 BIR 结构域则被截短，Survivin-2B 的 BIR 结构则被隐藏外显子 2b
5、 编码的肽段插入而发生断裂。3不同的剪切异构体似乎有独特的亚细胞定位和功能3 。其中Survivin-2B 抗凋亡功能显著下降，呈斑点状分布于细胞质中，Noton 等4在构建表达 Survivin-2B-GFP 细胞系时遇到困难，说明 Survivin-2B 的表达可能有细胞毒性。强制表达 Survivin-2B会诱导癌细胞发生凋亡已有报道5 。也有研究证实 Survivin-2B与良好预后有相关性，在、期结直肠癌中的表达低于、期6 。这些证据说明 Survivin-2B 在结直肠癌中起负调节作用，故而有学者认为 Survivin-2B 是一种天然的 Survivin 拮抗剂，具有保护作用。S
6、urvivin-Ex3 保留抗凋亡特性，主要定位于细胞核内，仅很少一部分位于线粒体内，胞浆内则无表达7 。Taubert 等构建的多变量 Cox 比例风险回归模型表明，Survivin-Ex3 过度表达的肿瘤患者死亡风险会上升 7.3 倍8 。两种新发现的剪切异构体尚有待进一步的研究，但均与凋亡有密切关系。不同剪切异构体对结直肠癌的差异影响尚需深入研究。值得注意的是，在期结直肠癌病人中，不表达 Survivin 的患者 5 年生存率为 94，与期患者没有区别，且对辅助治疗反应佳；表达 Survivin 的患者 5 年生存率仅为 52，接近期患者，对辅助治疗也不敏感9 。这有助于在临床上区分期结
7、直肠癌病人，以决定是否使用辅助治疗，从而提高患者的生存期。2 Survivin 与细胞凋亡4Survivin 是一种同时具有调控细胞凋亡和细胞增殖双重功能的调控子10 。本文着重讨论 Survivin 的抑制凋亡功能与结直肠癌靶向治疗的关系。Survivin 是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，其抑制细胞凋亡的作用远远大于 bcl-2 家族成员。越来越多的证据表明，Survivin 同时调控着 caspase 依赖的和非 caspase 依赖的凋亡途径。Survivin阳性的正常成年组织的线粒体中不含 Survivin，但众多种类的癌细胞的线粒体中存在一个 Survivin 池，在细胞凋亡信号的刺
8、激下，线粒体内的 Survivin 迅速释放入胞浆，以同源二聚体的形式与caspase-3 或 caspase-7 形成稳定结合，阻止 caspase 激活，使二者的蛋白切割作用失效，进而抑制 caspase-9 介导的细胞凋亡11 。运用泛 caspase 抑制剂只能部分降低 Survivin 的抗凋亡能力，证实 Survivin 在非 caspase 依赖的凋亡途径中发挥调控作用12 。Survivin 还存在胞质池和核内池，免疫组化方法研究过程中观察到某些抗体只能识别二者之一，而部分抗体可同时识别两者，这两个 Survivin 池各自的作用及其调控机制值得进一步探讨。有报道称结直肠癌病人
9、如有 Survivin 在胞质内表达，则具有保护作用，相对危险度为 0.3513 。Survivin 的亚细胞分布若能应用于预后评分，5辅助临床医师对结直肠癌病人进行分类，则有利于实现个性化治疗。3 Survivin 靶向治疗结直肠癌目前针对 Survivin 靶点的肿瘤治疗有 4 类3：（1 ）抑制Survivin 的表达，包括运用反义寡核苷酸、反义表达载体、RNAi、核酶、抗癌药物等；（2）抑制 Survivin 的功能，包括应用显性失活突变体、药物抑制剂、肽模拟物等；（3）应用 Survivin 的cDNA、RNA、蛋白质或肽段的免疫治疗；（4）应用 Survivin 启动子于肿瘤特异性
10、细胞毒性基因。3.1 抑制 Survivin 的表达 反义包括反向表达载体和人工合成反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASON） ，后者更适用于临床应用。Penuelas 等14 用 21-mer ASON 作用于结直肠癌细胞，能够提高其对化疗药物（甲氨蝶呤）的敏感度。siRNA 具有相对于 ASON 有更强的效力和抗降解能力，已成为近几年的主流靶基因沉默手段。运用 siRNA 下调 Survivin 的表达，可以促进直肠癌细胞 DNA 双链的断裂，终而表现为病人对放疗的敏感性提高，说明 Survivin 可以充当预后因子，用于判断病人对放疗的反应度15 。基
11、于 Survivin 在肿瘤的新生血管内皮细胞中也呈现过度表达的事实，Coma 等 16同时运用 ASON 和 siRNA 于血管内皮6细胞，发现 Survivin 在 mRNA 和蛋白水平均下调，不仅凋亡细胞上升 4 倍，内皮细胞的生长被强烈抑制，且内皮细胞的迁移能力被抑制并有剂量依赖效应，内皮细胞的乳头状腔管形成能力也下降了。该实验亦证实，siRNA 在 30100nM 水平上即可达到 ASON 在800 1000nM 水平时才能达到的抑制效果，不难得出 siRNA 的效力更强的结论。寻找最佳靶片断是这两种方法的成功关键，其方法学仍在进一步讨论之中。EPR-1 是天然的反义 Survivi
12、n，诱导其在人类结肠癌细胞系的表达，能下调 Survivin，导致了癌细胞的增殖能力下降，凋亡增多，且能提高对抗癌药物的敏感度17 ，这种方法可以克服反义寡核苷酸基因治疗存在的特异性差、基因传递不完全的缺点，具有良好应用前景。核酶是具有特异核酸降解能力的 RNA 小分子，某些锤头酶可以特异性地降解 Survivin 的 mRNA，但此法主要应用于实验室，距临床应用还有很大距离。非甾体抗炎药 Sulindac 能持续抑制 Survivin 的 mRNA 和蛋白水平上的表达，对结直肠癌有抑制能力和预防作用18 ，具体机制可能是上调 Wnt 通路的 APC 蛋白及降解 catenin，前者可以直接抑
13、制 Survivin 的表达，后者的下调会减少 T 细胞因子(T cell factor，Tcf)的激活，转录激活子 catenin/Tcf 复合体的靶基因Survivin 也随之下调。7进行小分子化合物的筛选，寻找具有良好治疗效果的物质，是一条不容忽视的有效途径。ICG-001 在体内和体外实验中均可特异地下调 catenin/Tcf 的靶基因，强烈抑制结直肠癌细胞中 Survivin的表达，诱发凋亡19 。能够抑制 Ras 信号通路的 LY294002，同样通过抑制 Survivin 诱发大规模的细胞凋亡20 ，提示 Ras 通路对 Survivin 的研究价值。3.2 抑制 Surviv
14、in 的功能 有丝分裂起始蛋白 cdc2 对 Survivin的第 34 位苏氨酸（T34 ）磷酸化后，后者才能发挥其抗凋亡的功能，应用药物抑制剂（purvalanol A） 、基因修饰或分子靶向攻击等抑制cdc2 活性的手段均能导致癌细胞的大规模凋亡。周期素依赖激酶抑制剂 flavopiridol 能够抑制 p34cdc2，从而阻断 Survivin 的 T34磷酸化，进而诱导癌细胞凋亡21 ；多柔比星能上调 Survivin-2B，同时下调 Survivin 和 Survivin-Ex3，与 flavopiridol 的作用有协同效应，可诱导细胞凋亡并抑制嫁接癌的生长。化疗药奥沙利铂可以显
15、著抑制结直肠癌细胞 Survivin 的表达，提高癌细胞对紫杉醇的反应，很可能是奥沙利铂抑制了 cdc2 的功能。但紫杉醇和奥沙利铂的应用顺序对疗效有影响，先用紫杉醇或二者同时应用均表现为协同效应；若先用奥沙利铂则表现出明显的拮抗作用，具体机制不明22 。8显性失活突变体主要有两种，一种是针对 Survivin 被 cdc2 磷酸化的位点的 SurvivinT34A（第 34 位苏氨酸突变为丙氨酸） ；另一种是 BIR 结构发生断裂的 SurvivinC84A（第 84 位半胱氨酸突变为丙氨酸） 。显性失活突变体虽可诱导结直肠癌细胞自发凋亡，抑制体内肿瘤生长，也能提高紫杉醇诱导的凋亡，但在临床
16、应用中尚存在困难23 。运用肽模拟物 shepherdin24 ，以 Hsp90 和 Survivin 的结合点为靶点，能诱导强烈的凋亡，同时不影响正常细胞的成活力，且能抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，未见明显毒性。3.3 针对 Survivin 的免疫治疗 Casati 等25 选择的一段Survivin 十肽具有很强的 HLAA2 结合能力，应用于结直肠癌病人后，能在其外周血中检测到特异的 CD8+T 细胞和 CD4+T 细胞，是一种很有价值的肿瘤相关抗原（tumorassociated antigen，TAA） 。此靶点十分理想，因 Survivin 在癌细胞以外的正常组织中沉默，且与病程进展无关。另有报道在很多肿瘤患者的外周血中都有 Survivin-2B80-88 特异的细胞毒性 T 细胞，很有希望成为 HLAA24+肿瘤患者的强效
