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1、1中期因子在急性髓系白血病患者的表达及临床意义作者：杨琳，董作仁，潘崚，罗建民，徐世荣【摘要 】 为了探讨中期因子(midkine，MK)与急性髓系白血病(AML)患者预后的关系，本研究采用半定量 RT-PCR方法检测 65例M患者与 15例正常人骨髓单个核细胞(MNC) MK、bcl-2 mRNA的表达，并对 20例 AML患者和 5例正常人采用 Western blot检测 MNC中 MK基因的表达。结果显示：初治组、复发组和化疗缓解组 MK基因表达水平分别为 0.3310.436，0.3740.463和 0.0670.190，正常人 MK基因表达阴性； MK基因表达阳性与表达阴性患者的首
2、次完全缓解（CR）率分别为 63.16%和93.55%（P=0.01） ，MK 基因表达阳性患者的复发率（ 100%）明显高于表达阴性者（40%） （P=0.019） ；多药耐药组与药物敏感组MK基因的表达率分别为 57.69%和 25.64%（P0.01） ； MK与bcl-2基因表达呈正相关（r=0.556 ，P0.001） 。结论：AML 患者白血病细胞可以产生 MK，且 MK阳性率的高低与 AML病期相关，是影响 AML患者近期预后的重要因素之一。MK 可能通过上调bcl-2的表达抑制白血病细胞凋亡。 【关键词】 急性髓系白血病2Expression of Midkine in Pat
3、ients with Acute Myeloid Leukemia and Its SignificanceAbstract The study was aimed to investigate the expression of midkine (MK) in bone marrow mononuclear cells (BM MNC) from 65 acute myeloid leukemia patients and 15 normal controls. The method of RT-PCR was used to examine the expression of MK mRN
4、A in BM MNC. Parts of samples were incubated for 24 hours and the gene expression of MK in the BM MNC was detected by means of Western blot. The results showed that the expression of MK of BM MNCs in 50 newly diagnosed AML patients (0.3310.436) and 15 AML patients in relapse （0.3740.463）were markedl
5、y higher than that in 15 CR cases (0.0670.190)，and 15 normal controls（0 ） ，respectively. The complete remission in MK positive patients （63.16%）was significantly lower than that in MK negative group（93.55%）. The patients with positive MK expression had a higher relapse rate than those with negative
6、MK expression. The positive rate of MK gene expression in drug-resistant patients and drug-sensitive patients were 57.69% 3and 25.64% respectively and there was positive correlation between the gene expressions of MK and bcl-2 （P0.01） (r=0.0556，P0.001). It is concluded that MK can be secreted by AML
7、 cells and involved in drug-resistent，its positive expression may be associa-ted with the poor prognosis in newly diagnosed AML patients. The inhibitory effect of MK on apoptosis of leukemic cells is induced by upregulating bcl-2 expression.Key words acute myeloid leukemia； midkine； prognosis中期因子(mi
8、dkine，MK)基因是近年来新发现的肝素结合性生长因子，其多种生物学活性与癌有关。近几年国外研究报道，MK在多种人类肿瘤组织中高表达，并参与肿瘤发病过程1-3 。在髓系白血病细胞株中发现 MK的异常表达，它可能参与白血病的发生、发展4 。对 AML患者表达情况的临床研究目前尚未有报道。我们分别应用 RT-PCR和 Western blot 检测了初治组、化疗完全缓解组、复发组 AML患者 MK基因与蛋白表达水平的变化，探讨MK表达与 AML的近期预后和细胞凋亡的关系，推断其在 AML发病中的可能作用。4材料和方法病例65 例 AML 患者包括 50 例初治患者，15 例复发患者，15 例健康
9、志愿者作为正常对照。 患者均符合 FAB诊断标准5 ，其中 M1 1例、M2 12例、M3 19例、M4 15例、M5 17例、M6 1例。男 36例，女 29例，中位年龄为 32（14-64）岁。15 例健康志愿者中男 9例，女 6例，中位年龄 35（18-55）岁。髓系细胞株 K562、HL-60 由中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心提供。逆转录-聚合酶链反应（ RT-PCR）应用 TRIzoL提取 BMMNC的总 RNA，然后逆转录成cDNA并进行 PCR扩增。MK 上游引物：5-CCA GGCTTGGCGTCTAGT-3，下游引物：5-ATGCAGCACCGAGGCTTCCT-3，
10、扩增产物 445 bp。bcl-2 的上游引物：5-CAACATCACCTATTGGATCC-3，下游引物：5-CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT-3，扩增产物 318 bp。由对照GAPDH的上游引物：5-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGATA-3，下游引物：5-AGCCTTCTCCATGGTTGGTGAACAC-3，扩增5产物 374 bp。扩增条件：对 MK，94变性 45秒，60 退火 1分钟，72延伸 2分钟，35 个循环；对 bcl-2，94变性 60秒，61退火 50秒，72延伸 50秒，30 个循环。对 GAPDH，94变性 40秒，55退火 60秒，72延伸
11、60秒，20 个循环。取 4 l扩增产物，同时加入 4 l GAPDH 扩增产物，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙啶） ，90 V，45 分钟，Eagle Eye 读胶仪扫描定量，以 MK/GAPDH、bcl-2/GAPDH 的比值作为其 mRNA相对表达水平。细胞孵育随机选取 20例急性髓系白血病患者（包括复发患者 2例，缓解期患者 2例） ，5 例正常人，分别无菌抽取骨髓 5 ml，无菌条件下以淋巴细胞分离液（密度 1.077）分离单个核细胞，用 RPMI 1640培养液洗 2遍，以 5106/ml的接种密度将细胞接种于RPMI 1640培养液中（无血清） ，于细胞培养箱中孵育 24小
12、时（孵育条件：温度 37，CO2 5%） 。孵育后 1 200g离心 5分钟分离细胞和培养液，用部分细胞提取总 RNA，用 RT-PCR方法检测 MK mRNA（方法同前） ；并取 1107细胞进行裂解，成匀浆后取上清液（相当于 3 mg组织蛋白）用于 Western blot分析。Western blot分析6取 15 l匀浆后的上清液与 15 l上样缓冲液充分混匀后进行 10% SDS-PAGE电泳，并转印至 PVDF膜上，膜用 1% BSA和0.05% Tween 20封闭 1.5小时，抗 MK单克隆抗体（1100 稀释）4过夜，过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG二抗孵育 1小时，DAB显
13、色并照相。临床耐药标准4 一线药物诱导治疗无效；第一次诱导缓解后 6个月内复发；第一次诱导缓解后 6个月后复发再次诱导治疗无效； 2 次或 2次以上复发者。按照该标准将 65例患者分为多药耐药组和药物敏感组，其中多药耐药组 26例，药物敏感组 39例。临床治疗方案对初治 AML（ M3除外）患者采用 DA方案（阿糖胞苷、柔红霉素）化疗诱导缓解。对复发 AML患者分别采用 AME（阿糖胞苷、米托蒽醌、足叶乙苷） 、IA（阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素）等方案。M3 患者采用全反式维甲酸（ATRA）或以 ATRA为主，联用小剂量 DA、HA（阿糖胞苷、高三尖杉酯碱）方案诱导分化或 ATRA加 As2O3
14、治疗，复发 M3者应用 As2O3治疗或标准化疗。7统计学处理SPSS 10.0统计软件分析处理，采用 t检验、 2检验及四格表确切概率法。结果AML MK mRNA表达及其与 FAB分型的关系因 M1、 M6、M7 病例数少或缺如，在方差分析时去除。本研究只分析了 M2、M3、M4 、M5 4种类型患者中 MK的表达，应用方差分析，P0.05，由此认为 4种类型患者 MK表达不具有统计学差异。正常人及 AML患者 MK mRNA和蛋白的表达AML患者 MK基因的阳性表达率及平均表达水平见表 1。同等扩增条件下，15 例正常人均未检测到 MK基因阳性表达。初治组、复发组 MK基因表达率及表达水
15、平明显高于缓解组（P0.05） 。初治组与复发组相比，无显著性差异（P0.05） 。所有 MK蛋白与其mRNA表达相平行（图 1、2） 。Table. Expression of MK mRNA in newly diagnosed AML，relapsed AML，AML-CR and normal control （略）8MK 表达与 AML临床疗效的关系按 MK表达情况将 50例初治 AML患者分成两组，MK 阳性组 CR率为 63.16%（12/19） ，MK 阴性组 CR率为93.54%（29/31） ，两组差异有显著性(P=0.010)，MK 表达阴性组的化疗疗效比阳性组高；对其中
16、 35例 CR患者进行 15个月的随访，随访终点为复发或死亡，其中 5例 MK阳性患者均在 1年内复发，30例 MK阴性患者中有 12例复发，其无病存活率为 60%，两组差异有显著性（P=0.019） 。将 65例 AML患者分为多药耐药组和药物敏感组，多药耐药组 MK mRNA的表达率和平均表达水平明显高于药物敏感组 (P0.01)。MK mRNA表达与 bcl-2之间的关系为研究 MK与 bcl-2的关系，我们对 65例 AML患者进行bcl-2 mRNA水平检测，采用直线相关分析发现 MK基因表达与bcl-2呈正相关（ r=0.555，P 0.05） 。结果见图 3。肝素结合性生长因子对于肿瘤形成有重要作用。MK 是近年来发现的一种新的肝素结合生长/分化因子家族成员之一，其结构明显不同于其它已知的生长因子，但生物学活性类似 FGF。在小鼠胚9胎形成中期，MK mRNA高度表
