《胆汁酸合成增加与肝D-双功能蛋白表达增强、活性升高的相关性》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胆汁酸合成增加与肝D-双功能蛋白表达增强、活性升高的相关性（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1胆汁酸合成增加与肝 D-双功能蛋白表达增强、活性升高的相关性【摘要 】 目的： 观察胆汁酸合成增多时，DBP 的表达和活性的改变，从整体水平上探讨 DBP 在胆汁酸合成中的作用. 方法： 给 C57BL/6J 小鼠 T0901317 及给 Wistar 大鼠饲喂高胆固醇食物，两条途径激活肝 X 受体（LXR） ，上调 CYP7A1 的表达增加胆汁酸的合成后，用全自动生化分析仪测定粪胆汁酸，用 RT-PCR 的方法测定 LXR 的下游基因胆汁酸合成限速酶 CYP7A1，以及 DBP 的mRNA 水平；用 Western Blot 测定 DBP 的蛋白水平；用分光光度法测定 DBP 活性. 结果
2、： LXR 被 T0901317 或高胆固醇食物激活后，CYP7A1 的 mRNA 增加（P0.05） ，导致粪中胆汁酸排出增加（P0.05）的同时，小鼠、大鼠肝 DBP 的 mRNA 水平、催化活性以及小鼠的 DBP 蛋白水平也随之增加（P 均小于 0.05）. 结论：DBP 在整体水平参与了胆汁酸合成并发挥重要作用. 【关键词】 D-双功能蛋白 胆汁酸类和盐类/ 生物合成 肝 X 受体 胆固醇 7-羟化酶【Abstract】AIM: To investigate the physiological role of DBP in bile acid biosynthesis through
3、determining the 2change of its expression and activity when bile acid biosynthesis increases. METHODS: To activate LXR and increase bile acid synthesis,C57BL/6J mice were fed T0901317 for 7 d and Wistar rats were fed a high-cholesterol diet for 2 wk. Fecal bile acid was measured by auto-biochemical-
4、analysis apparatus. The expression of CYP7A1 and DBP mRNA was analyzed by RT-PCR. DBP protein was estimated by Western Blot. DBP activity was measured by spectrophotometry. RESULTS: Fecal bile acids (P0.05), the mRNA expression of CYP7A1（P0.05）and DBP (P0.01),and activity of DBP（P0.05）in liver of C5
5、7BL/6J mice treated with T0901317 and Wistar rats fed high-cholesterol diet were higher than that in the corresponding control groups. The liver protein level of DBP in mice treated with T0901317 also increased (P0.05). CONCLUSION: DBP is involved in the bile acid biosynthesis in vivo.【Keywords】 DBP
6、；bile acid sand salts/biosynthesis；LXR ； cholesterod 7-alpha-hydroxylase0 引言3胆固醇由限速酶胆固醇 7 羟化酶（CYP7A1）催化，生成7-羟胆固醇，进而生成胆汁酸前体三羟或二羟胆甾烷酰辅酶 A (THC-CoA 或 DHC-CoA)后，经过氧化物酶体 氧化生成胆汁酸. 但 氧化中加水、再脱氢两步反应由何酶催化？知之甚少. 我们发现, 过氧化物酶体内 D-3-羟脂酰辅酶 A 脱水酶D-3-羟脂酰辅酶脱氢酶，简称 D-双功能蛋白（ DBP） 1-2 ，能在体外催化胆汁酸前体脱水与脱氢3-4 . 但在体内 DBP 是否与胆
7、汁酸合成有关有待确定我们用 T0901317 和高胆固醇分别激活 C57BL/6J 小鼠和Wistar 大鼠肝 LXR5-6 ，上调其靶基因 CYP7A1 的表达，增加胆汁酸的合成后，观察 DBP 表达和活性改变，进一步确定 DBP 在体内胆汁酸合成中的作用.1 材料和方法1.1 材料 20 只 810 周龄成年雄性 C57BL/6J 小鼠由北京实验动物中心提供，20 只 10 周龄成年雄性 Wistar 大鼠由河北医科大学实验动物中心提供；T0901317 为 Cayman 公司产品；（）-3-羟基癸酰酸、 S- -苯乙胺、辅酶 A(HS-CoA)，L-乳酸脱氢酶(LDH)为 sigma 公
8、司产品；异硫氰酸胍、十二烷基肌氨酸钠、RT 试剂盒为 Promega 公司产品； Taq DNA 聚合酶为鼎国化学试剂公司产品. PCR 引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成 . 其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯.41.2 方法1.2.1 动物分组及取材 将小鼠随机分为对照组和激动剂组，每组 10 只. 两组均给予普通小鼠饲料. 激动剂组用 LXR 激动剂T0901317 灌胃（20 mg/kgd） ，对照组只给予 T0901317 的溶解剂，连续灌胃 7 d. 灌胃第 7 日时，将小鼠单笼饲养，收集 24 h 粪便，用于粪便胆汁酸测定. 灌胃第 8 日，小鼠麻醉后，迅速取出肝脏，置液氮中
9、，用于总 RNA 提取、DBP 蛋白量及活性测定. 将大鼠随机分为两组，每组 10 只，高胆固醇组，给以高胆固醇饲料（100 g 高胆固醇饲料中含有 2 g 胆固醇，10 g 玉米油，88 g 标准饲料）喂养；对照组，给以标准饲料喂养. 饲养至第 2 周. 尾静脉取血，确认 CH 组血胆固醇（2.7290.757 ）mmol/L 高于对照组（1.4260.257 ）mmol/L 后，麻醉大鼠，迅速取下肝脏，置液氮中，用于总 RNA 提取及 DBP 活性测定. 处死大鼠前 1 d 单笼饲养收集 24 h 粪便，用于粪便胆汁酸测定 .1.2.2 肝脏 DBP 活性测定 按参考文献1 的方法制备肝匀
10、浆，按参考文献7的方法制备 D-（-）-3-羟辛酰辅酶 A. 本实验以 D-（-）-3-羟辛酰辅酶 A 为底物用分光光度法测定肝匀浆中DBP 的活性4. 酶活性单位用 kat/kg 表示. 蛋白质采用改良5Lowry 法定量 8.1.2.3 肝组织 CYP7A1 和 DBP mRNA 水平测定 采用异硫氰酸胍一步法提取肝组织总 RNA9. 以 -actin 为内参照，RT-PCR 法测定 CYP7A1，DBP mRNA 的相对表达量. 用凝胶成像分析系统分析经琼脂糖凝胶电泳分离的扩增产物的灰度值. 相对表达量以目的基因与 -actin mRNA 的灰度值之比表示 . DBP PCR 引物： 5
11、AAGTGATGAAGACTGGGATA3，5TGTAGGCAAACAGGAGAA3，产物 793 bp；大鼠 CYP7A1 引物：5GCCGTCCAAGAAATCAAGCAGT3，5TGTGGGCAGCGAGAACAAAGT3，产物 305 bp；C57BL/6J 小鼠 CYP7A1 引物：5CTGCTACCGAGTGATGTTTG3，5ACTTCTTCAGAGGCTGCTTT3产物 423 bp；-actin PCR 引物：5GAGACCTTCAACACCCCAGCG3，5TCGGGGCATCGGAACCGCTCA3，产物 404 bp.1.2.4 肝组织 DBP 蛋白水平测定 采用 We
12、stern blot 法测定肝组织 DBP 蛋白水平. 取 C57BL/6J 小鼠肝组织制成匀浆，4离心后取上清，用改良 Lowry 法进行蛋白总量测定 . SDS-PAGE 电泳的蛋白上样量为 220 ug. 经过转膜和封闭处理后，对 PVDF 膜加入DBP 一抗（兔抗人） ，室温静置过夜，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔 ). 最后用 4-氯-1 萘酚显色液显色，凝胶成像分析系6统照相并分析每个条带的积分光密度值.1.2.5 粪胆汁酸的测定 参照文献10的方法，用无水乙醇分别从 C57BL/6J 小鼠和 Wistar 大鼠干燥至恒重的粪便中提取胆汁酸. 用 Olympus Au270
13、0 型全自动生化分析仪测定胆汁酸，以每克干燥粪便中含有胆汁酸的微摩尔数表示粪中胆汁酸含量（mol/g）. 统计学处理 实验数据以 xs 表示，用 SAS 软件进行统计学处理. 两组均数间比较采用 t 检验，两变量间相关性采用直线相关分析. 以 P0.05 为有统计学意义.2 结果2.1 胆汁酸水平 激动剂组 C57BL/6J 小鼠和高胆固醇组大鼠的粪便胆汁酸量(mol/g)均高于各自的对照组（1.3230.277）vs（1.0080.205） ， （5.5391.710）vs （0.5750.125） .2.2 肝脏 CYP7A1, DBP mRNA 水平 激动剂组 C57BL/6J 小鼠（图
14、 1A，表 1）和高胆固醇组大鼠（图 1B，表 1）肝CYP7A1，DBP mRNA 表达量均高于各自的对照组.A： 小鼠；B： 大鼠.7图 1 肝 CYP7A1 和 DBP 的 RT-PCR 扩增产物电泳（略）表 1 小鼠和大鼠肝 CYP7A1 和 DBP mRNA 的表达（略）aP0.05,bP0.01 vs 对照2.3 肝脏 DBP 活性的改变 激动剂组 C57BL/6J 小鼠和高胆固醇组大鼠肝脏的 DBP 活性（mkat/kg,n=10）均高于各自的对照组(0.250.045) vs (0.1850.04) ，(0.1930.032) vs (0.1470.042).2.4 C57BL
15、/6J 小鼠肝脏 DBP 蛋白量的改变 激动剂组C57BL/6J 小鼠的 DBP 蛋白表达量（121.0 ，n=8）高于对照组（10.750.866，n=8，P0.05,图 2）.图 2 Western blot 分析 C57BL/6J 小鼠肝 DBP 的蛋白表达量（略）2.5 肝脏 DBP 与 CYP7A1 mRNA 水平的相关性 经直线相关分析，C57BL/6J 小鼠肝脏 DBP mRNA 与 CYP7A1 mRNA 的表达量呈正相关（r=0.6555，P0.05） ；大鼠 DBP mRNA 与 CYP7A1 8mRNA 的表达量也呈正相关（r=0.74,P0.05）.3 讨论胆固醇转化为
16、胆汁酸是机体胆固醇排出体外的主要途径. 胆固醇向胆汁酸的转化除了与其合成的限速酶 CYP7A1 的活性有关外，还涉及胆固醇侧链在过氧化物酶体中的氧化缩短过程. 本实验用LXR 人工合成配体 T0901317 和高胆固醇饮食两条途径激活 LXR，增强其下游基因 CYP7A1 的表达后，微粒体内生成增加的 7-羟胆固醇经羟化、连接辅酶等反应转变成 27 碳的胆汁酸前体 THC-CoA 或 DHC-CoA. 后者再经过氧化物酶体 -氧化缩短侧链后转变成胆汁酸，导致粪便胆汁酸生成增多. 与此同时，过氧化物酶体 -氧化途径中催化第二步水化反应和第三步脱氢反应的 D-双功能蛋白的 mRNA 和蛋白表达增强，并与 CYP7A1 mRNA 表达呈正相关. 表明：LXR 激活后，胆汁酸生成增多不仅与胆汁酸合成的限速酶CYP7A1
