《肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立作者：杨国柱， 傅思莹， 黄冰， 单于， 肖东， 马芸， 邓新燕，陈系古【摘要 】 【目的】 制备 TRE-HCV-C 转基因小鼠,为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠，以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础,更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCVC）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。 【方法】 重组构建含有目的基因HCVC、TRE 序列和 SV40 polyA 的转基因载体 pTRE-HCV-C，以显微注射的方法将 1.153 kb 的转基因片段注入 BALB/C 母
2、鼠的受精卵，出生动物及其后代经 PCR 初步筛选出阳性，再经 Southern 杂交对阳性鼠基因组 DNA 标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子 ApoE 和 rtTA 基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代 F1 小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCVC 在肝脏中特异性的可调控性的表达。 【结果】 产生了 5 只整合有 TRE-HCV-C 基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子 ApoE 和 rtTA 基因的转基因小鼠杂交后，得到子代 F1 小鼠，特定时间与 DOX 作用后，小鼠肝脏2的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C 小鼠为丙
3、型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。 【结论】 成功制备了 HCV-C 转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究 HCV中的 C 基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达 HCV-C 基因双转基因小鼠模型奠定基础，也是 HCV-C 基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。 【关键词】 HCVC ； 丙型肝炎病毒核心蛋白 ; 转基因小鼠模型；四环素调控系统； 组织特异性表达1992 年，Gossen 等1提出了一种可控的、高效的基因表达系统，称 Tet-off 基因表达系统。该系统主要由四环素调控激活因子（tetracycline-contr
4、olled transactivator, tTA）和四环素反应元件（tetracycline responsive element, TRE）组成。该系统可以使基因的表达随着四环素浓度的增加以一种剂量依赖性的方式逐渐关闭甚至为零。1995 年，Gossen 等2通过改变 tTA 的氨基酸顺序得到一四环素反式激活因子（reverse tetracycline-controlled transactivator, rtTA）, 构建了 Tet-on 基因表达系统。该系统在没有四环素的情况下基因表达水平为零，而在四环素或其衍生物强力霉素(doxycycline ,Dox) 存在时，rtTA 即与
5、TetO 结合启动转录。目前越来越多的研究采用四环素调控系统，将其运用于动物模型从而实现某些基因的时空表达来研究此类基因的功能。C 蛋白是丙型3肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)编码的一种重要的结构蛋白，越来越多的研究结果表明 C 蛋白与 HCV 感染所致肝细胞癌的发生有密切关系3，但由于 HCV 具有极强的宿主特异性，目前对 HCV及 C 蛋白的机制和功能的研究仅仅限于细胞模型，缺乏合适的小动物模型严重阻碍了在动物整体水平上的研究4。因此本研究应用四环素调控系统构建了携带 TRE-HCV-C 的转基因小鼠，为实现丙肝核心蛋白在肝脏的时空特异性的表达提供了一个极为有利的模
6、型。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物 种鼠为性成熟的 BALB/C 鼠,结扎公鼠为性成熟的 BALB/C 鼠,供卵鼠为 46 周龄 BALB/C 鼠。假孕鼠为 8 周龄BALB/C 鼠(均为中山大学药学院实验动物中心提供)。1.1.2 工具酶与试剂 质粒 pHCV-MA 由日本 Prof. Akio Nomoto 馈赠， pTRE 由美国阿肯色州医学研究中心范春阳博士馈赠。宿主菌 E.coli JM-109 由本实验室保存。限制性内切酶Xho,Hind, EcoR, Xba（TaKaRa 公司） ，质粒 DNA 提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR 纯化试剂盒（QIAGEN 公司） ，T
7、aq酶，dNTP，T4DNA 连接酶，Milli-Q 超纯水（Gibco 公司） ，蛋白4酶 K（TaKaRa 公司） ，M2、M16、透明质酸酶（Sigma 公司） ，North2 South Direct HRP Labeling and Detection Kit(PIERCE公司)。PCR 引物( 根据 Genbank 自行设计) 。孕马血清(pregnant mare serum,PMS)和人绒毛膜促性腺激素( human chorionic gonadotropin, HCG) 均购自天津市华孚生物制品公司。鼠源性抗HCV-C 蛋白单抗购自 CLONTECH 公司。1.2 转基因载
8、体的构建使用 QIAquick Plasmid Extraction Kit 提取质粒 pHCV-MA（内含目的片段 HCV-C cDNA 序列）作为模板（Template） ，根据 2b 型 HCV 全长 cDNA 序列3(Genebank 登录号：AB030907)设计上下游引物 P1 和 P2， PCR 扩增 HCV-C 基因片段，目的片段长度为 573 bp。P1 5-GGCGAATTCATGAG CACAAATCCTAAACC-3；P2 5-GCTCTAGATGA AGACACTGGCACTGTAACG-3。上游引物包含基因的起始密码和EcoR酶切位点，下游引物包含基因的终止密码和
9、Xba酶切位点。PCR 产物及质粒载体 pTRE 分别进行 EcoR和 Xba双酶切。酶切产物使用 QIAquick Gel Extraction 进行琼脂糖凝胶电泳回收纯化。纯化的双酶切质粒 pTRE 与 PCR 产物（C 片段）进行连接。5按 Qiagen 试剂盒说明进行质粒提取与回收。质粒 pTRE-HCV-C用 Xho和 Hind 酶切,其片段长度为 1.513 kb。QIAGEN 胶回收试剂盒回收目的片段。1.3 受精卵的显微注射回收并纯化注射片段，按常规进行显微注射和受精卵移植5。1.4 转基因鼠的基因型鉴定1.4.1 鼠尾 DNA 提取 剪切鼠龄 3 周的鼠尾 3 mm,按文献5
10、制备基因组 DNA 作为模板。1.4.2 PCR 检测 利用特异性引物扩增 ,产物长度为 573 bp，其引物序列同 1.2。PCR 反应条件:97 变性 7 min,进入循环(94 45 s，56 45 s，72 60 s)，共 30 个循环,最后一个循环在 72 延伸 7 min。10 g/L 的琼脂糖 40 V 电泳。1.4.3 Southern 杂交检测 取 PCR 筛选阳性鼠 DNA 10 g， 经 37 酶切过夜 ,阳性对照和阴性对照分别为质粒 DNA 和正常 BALB/C 鼠 DNA 分别经 Xho 和 Hind 酶切后的产物。探针为质粒 pTRE-C 经 EcoR和 Xba双酶
11、切后的片段,长为 573 bp。61.5 RT-PCR 检测转基因小鼠体内 HCVC 基因的 mRNA 表达利用 rtTA 工具鼠（本实验室同期制作）来检测转基因阳性的首建鼠中 HCVC 蛋白的表达。选用 PCR 检测和 Southern 杂交检测均为阳性的 HCV-C 转基因的首建鼠与 rtTA 鼠交配产仔。一定月龄的仔鼠经过上述检测，选取两种基因均有表达的双转基因鼠，给服DOX 达 1 个月后，剪取小鼠的各组织( 如心,肺, 肾,脾,肝等)，提取各组织总 RNA，并以其为模板进行 RT-PCR 扩增，引物序列同 1.2，扩增长度为 573 bp，-actin 引物序列：正义引物：5-GAT
12、ATCGCTGCGCTGGTCGT-3；反义引物：5-CGGAACCGCTCGTTGCCAAT-3，扩增长度为 220 bp。取 5 ?滋L PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳。1.6 HCV-C 时空特异性表达的检测同 1.5 选取两种基因均有表达的双转基因鼠，给服 DOX 达 1 个月后，进行肝组织的免疫化学检测6。活体麻醉摘取部分肝叶，将取下的肝叶一部分以 10%中性福尔马林固定，石蜡切片。免疫组织化学采用 SABC 法。抗体使用 HCV-C 单克隆抗体。将未做 HE 染色的石蜡切片作常规组织免疫化学处理。72 结 果2.1 转基因载体 pTRE-HCV-C 的构建根据 2b 型 HC
13、V 全长 cDNA 序列设计上下游引物后，PCR 扩增HCV-C 基因片段，通过电泳检测后结果表明：扩增得到目的片段HCV-C，大小一致（图 1） 。质粒 pTRE-HCV-C 用 Xho和 Hind 酶切,其片段长度为 1.513 kb，酶切前后电泳结果表明转基因载体 pTRE-HCV-C 构建成功（图 2,3） 。2.2 转基因小鼠的建立应用 PCR 进行初步筛选移植受精卵后产生的仔鼠，发现有 5 只为 TRE-HCV-C 转基因首建鼠(图 4)。Southern Blot 分子杂交分析结果表明，5 只 PCR 阳性鼠的基因组 DNA 均有 TRE-C 基因片段的整合（图 5） 。2.3
14、HCV-C 转基因小鼠的 HCV-C mRNA 组织特异性表达RT-PCR 结果表明，转基因小鼠的目的基因 HCV-C 在体内存在有组织表达的特异性（图 6） 。82.4 HCV-C 转基因小鼠时空特异性表达 HCV-C 蛋白免疫组织化学结果表明：喂饲 DOX 后的转基因小鼠的肝细胞胞质中存在 HCVC 蛋白的表达（图 7） 。3 讨 论对于丙型肝炎病毒 HCV 致病机制的研究是目前的热点之一，而C 蛋白是 HCV 编码的一种重要的结构蛋白，被认为在 HCV 感染的慢性化发展过程中以及 HCV 感染所致肝细胞癌的发生过程中扮演着十分重要的角色3,蛋白与 HBV 的 X 蛋白诸多类似，是抗病毒治
15、疗研究的重要靶位点，有助于探讨 HCV 的致病机制及其防治。然而，HCV 感染的宿主特异性决定了合适的动物模型的缺乏，严重阻碍了在动物整体水平上对 HCV-C 致病机制的研究。如果HCV-C 小鼠在胚胎期表达，就会对病毒抗原会形成免疫耐受,使得在小鼠体内不一定产生病理改变。那么我们就需要利用一个条件诱导基因表达的系统。四环素调控系统是目前最为广泛使用的条件性的基因调控系统。它具有以下的优点:基础表达水平低和诱导表达水平高; 目的基因表达能够人为地控制，调节特异性高,宿主基因不受影响, 无相关毒性; 在特定时间内调节范围较宽。9与我实验室同期构建的带有四环素调控系统调控元件 rtTA 的转基因小
16、鼠相呼应，本实验构建了带有四环素调控系统反应元件 TRE的 HCV 转基因小鼠，用显微注射方法将目的基因注入小鼠受精卵,出生动物及其后代经 PCR 筛选和 southern 杂交鉴定,成功地制备了整合有 TRE-HCV-C 的转基因首见鼠以及它们的子代，且证实了TRE-HCV-C 基因可以传代。在这个基础上，我们补充了国际上关于四环素小鼠资源库上的反应部分小鼠类别的一项空白，首次利用四环素反应元件 TRE 带上疾病相关蛋白 HCV-C 进行转基因小鼠的制作研究。理论上，四环素调控系统介导的时空表达 HCV-C 转基因小鼠在正常情况下应该不能表达 HCVC 蛋白，即目的基因处于沉默状态，而与表达 ApoE-rtTA 基因的四环素调控部分的转基因小鼠交配后获得同时带有两种外源基因的双转基因动物，在食物或饮水中加入DOX，小鼠就能在特定
