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1、一.名词解释细胞工程:以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学步骤，有目的的利用和改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。愈伤组织：脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生无组织结构无明显极性的松散的细胞团。外植体：用于离体培养的植物或组织片段极性（植物细胞）：植物器官、组织甚至单个细胞在不同的轴向上存在某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。不均等分裂是细胞极性建立的标志。动物细胞培养:是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌，适温和丰富的营养条件下，是离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。干细胞：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞
2、，根据来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。动物克隆：一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。前体：指某一代谢中间体的前一阶段的物质。一般在生物合成反应的中间过程中，某一阶段前的物质，都可以说是该阶段物质的前体物质。细胞融合：是指使用人工方法使 2 个或 2 个以上的细胞合并形成 1 个细胞的技术。单克隆抗体：经过免疫的哺乳类动物单一的 B 淋巴细胞，可以合成分泌单一性的抗体，我们称这种具有特异性的、同质性的抗体为单克隆抗体。组织工程：是利用生命科学、医学、工程学的原理与技术，利用细胞、生物材料、细胞因
3、子实现组织修复或再生的一门技术。细胞转化：是指细胞发生遗传改变而产生永生化，即由有限细胞系转化为连续细胞系，可以在体外进行无限传代和生长繁殖。胚胎干细胞：是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经过体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞，是可以分化成任何一种组织类型的细胞。动物细胞大规模培养：是指在生物反应器中高密度大量培养细胞用于生产生物制品的技术。看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。微载体：是直径 60250m 的适用于贴壁依赖型细胞生长的微珠。特点：1.好的生物相容性：无毒无害，有好的黏附性，一般带正电荷 2.大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一 3.良好的传质性
4、能 4.强的机械性能：重复利用、保护细胞 5.好的热稳定性：获能：是指精子获得穿透卵子透明带能力的过程。体细胞杂交：是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。多倍体：指体细胞中含有超过正常染色体组数的个体。二.简答题.1.动物细胞大规模培养定义及有哪些培养系统？答：动物细胞大规模培养是指在生物反应器中高密度大量培养细胞用于生产生物制品的技术。培养流程：组织消化原代培养传代培养（细胞系与细胞株）小规模培养（转瓶等）大规模培养（生物反应器）产品（1） 转瓶（管）培养系统：小量培养到大规模培养的过渡阶段。设计不同规格转瓶转管（2） 微载体培养：适用于贴壁依赖型细胞生长（
5、3） 中空纤维生物反应器培养（4） 玻璃珠培养1、单克隆抗体的技术流程?答：1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 2.骨髓瘤细胞的获得与培养 3.细胞融合 4 融合细胞的筛选 5.克隆化培养 6.分泌抗体的融合细胞的筛选 7.单克隆抗体的大量生产2、举例说明动物细胞培养在生物制药中的应用。答：1、病毒疫苗：脊髓灰质炎疫苗 麻疹疫苗 流行性腮腺炎疫苗 联合疫苗2、制备干扰素：人白细胞干扰素 成纤维细胞干扰素 类淋巴细胞干扰素3、单克隆抗体：人源化单克隆抗体，人鼠嵌合抗体3、胚胎干细胞应用中存在哪些问题?答：1、来源限制：人类胚胎干细胞研究存在细胞来源限制问题。2、体外培养困难：由于胚胎干细胞在体外
6、培养会自分化，而且机制还不非常清楚，控制胚胎干细胞分化的抑制技术有待完善，例如饲养层细胞与条件培养基还不成熟。3、安全性：胚胎干细胞和多能成体干细胞的自发分化方向是多向的，移植到体内的干细胞分化方向会与预期不同。干细胞移植后的成瘤性风险也比较大。4、伦理道德问题：获取人的胚胎干细胞，建立胚胎干细胞系必须要破坏胚囊，体外培养的胚囊是否具有生命还存在着争议，所以人类胚胎干细胞研究面临伦理道德的问题。4、试述细胞融合的方法、各方法的原理并分析其优缺点。答：一、生物法 病毒诱导细胞融合 原理：主要是由于病毒会与宿主细胞膜直接融合，同时进入两个细胞就会打破两个细胞膜的隔阂，引发细胞质的交流，进而达到细胞
7、融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣与动物细胞膜相似，病毒外壳上的某些糖蛋白有促进细胞融合的功能。缺点：要提前大量培养病毒，并且灭活后才能作为融合剂使用，操作繁琐，一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞二、化学法 PEG 诱导原理：化学法使细胞膜电荷平衡被打破，引起原生质体聚集，使原生质体接触，促进细胞融合。缺点：化学试剂可能对细胞有毒害作用。1.NaNO3诱导融合：NaNO 3对原生质体无损害，但融合效率低，一般小于 4%。2.高 pH 的高浓度 Ca2+离子诱导融合：钙离子中和原生质体膜或细胞膜表明表面电荷，使细胞彼此紧密接触，决定质膜的稳定性和可塑性；高 pH 能改变质膜的表
8、面电荷，利于细胞融合。 3.PEG 诱导：PEG 分子具有轻微的负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质、碳水化合物形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。当 PEG 分子被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另外一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。 4.高 Ca2+和 pH 诱导 PEG 结合：优点：基于 PEG 的诱导融合优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点：是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。三、物理法 电融合诱导法原理：在直流电脉冲的刺激下，细胞膜或原生质体质
9、膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种细胞或原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。PS 补充：细胞融合关键环节：（1）亲本选择（单细胞或原生质体制备）（2）两原生质体或细胞互相靠近，粘附（3）质膜融合形成细胞桥（4）胞质渗透（5）细胞核融合（6）融合细胞筛选5、化学方法诱导细胞融合可以分为哪几类?答：1、NaNO3 诱导融合 2、高 pH 的高浓度 Ca2+离子诱导融合 3、 4、高 Ca2+和 pH 诱导 PEG 结合6、胚胎干细胞分化潜能评价？答：1、体外分化试验 将获得的胚胎干细胞支撑悬浮液培养在铺有明胶的培养皿中
10、，一段时间后部分细胞贴壁生长，分化成神经、肌肉、软骨等不同组织细胞；同时一部分不贴壁的细胞悬浮生长，先生成“简单类胚体” ，进一步培养生成囊状胚体。2、体内分化试验：将一定量的胚胎干细胞注射进同源动物皮下，经过一段时间后，注射处皮下有组织瘤生成。手术取瘤，常规制片后观察，一般是含有三个胚层的畸胎瘤。3、嵌合体形成 将胚胎干细胞通过聚集法或者注射法与受体胚胎结合，并且将胚胎移植进同期化代孕母受体，最终得到嵌合体动物。嵌合体动物可以通过毛色、皮肤颜色等外观指标进行判定，或者取器官组织进行同工酶检测。4、核移植 以胚胎干细胞作为核供体移植到去核卵母细胞中，管擦重组胚是否能正常发育、产生个体。7、人工
11、种子结构上从里到外分为哪几部分，分别是什么？答：结构上从外向里包括三部分：（1）人工种皮外层：保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；最早采用的是聚氧乙烯，目前是海藻酸盐（2）人工胚乳：含有必需的营养成分和某些植物激素；主要包括无机盐蛋白质糖类 反反复及抗生素 农药等 （3）胚状体或芽8、影响植物细胞次级代谢产物的因素？1、生物因素：1细胞株：稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提。考虑到不同部位来源细胞的特性。2、细胞凋亡：细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象，但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡。3、细胞团： 细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持
12、，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响。4、生物合成机制：次级代谢产物的生物合成涉及多基因参与（基因簇） ，机制非常复杂，影响因素非常多。2、化学因素：主要通过合适的培养基选择来控制，包括营养盐、前体和调节因子等。1、营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物。2、前体：缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物。如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加。3、诱导子：狭义诱导子：是指那些能够与细
13、胞发生相互作用，通过细胞内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质。广义诱导子：是指所有能够提高细胞次生代谢相关酶活力，进而提高细胞次生代谢水平的外界因素。温度、光照、紫外线、红外线等都是广义诱导子3、反馈抑制：植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制。三物理因素（1）光照：光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物合成和积聚产生作用。光对许多酶有诱导或抑制作用。（2）温度：温度会影响酶的活性。细胞的生长速率与培养温度紧密相关。植物细胞培养一般在
14、 25左右进行。 、（3）植物细胞液体培养的 pH 变化范围在 56 之间，最佳的起始 pH 在5.55.8 之间。如果对培养液 pH 进行控制，将有利于次级代谢产物的生成。四工程技术问题（1）培养液的流变特性：由于植物细胞培养过程中容易结团，同时，不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质，从而使传氧速率降低，影响细胞生长。（2）气体传递：植物细胞通过光合作用合成有机物，因此氧气和 CO2 的含量与传递对培养过程影响较大。（3）搅拌与剪切力：植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆弱，对搅拌的剪切力敏很感。由于剪切力比较大，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低。(4)泡沫与器壁表面粘附性与微生
15、物细胞培养相比，植物细胞培养过程中产生的气泡更大，细胞很容易被包埋在泡沫里，造成非均相培养PS：提高次级代谢产物产量的途径培养设备：选择或设计合适的生物反应器。培养工艺：诱导子添加、前体喂养、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养条件（培养基、环境条件）优化与控制、流加培养。培养技术：固定化培养技术、两相培养技术、两步法培养（第 2 步细胞生长；第 2 步产物积累）9、详述核移植技术的一般操作程序？答：（1）核供体细胞获得与取核供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行 15 天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态（一般进入 G0 期）
16、。（2）受体细胞去核A、用微细玻璃管吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。B、用荧光染料 Hoechst33342 对卵细胞 DNA 进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率。C、使用 Hoechst33342 与卵细胞 DNA 结合后，用紫外线定点照射使核功能丧失。（3）细胞核移植细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法。（4）重组胚激活正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制，成熟的卵母细胞质能使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化，从而导致供核回复到初始状态，基因从头开始顺序表达。重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法。（5）重组胚培养和移植激活后的重组胚可以采用体内和体外两种培养方式。（6）体细胞核移植后代的鉴定对于体细胞核移植培育的动物，可以从形态性别上鉴定，还可以采用分子生物学技术鉴定。三.文献分析：不同理化因子对雪莲毛状根生长和总黄酮生物合成的影响文献分析：rhEPO-Fc 融合蛋白的表达、纯化及质量研究
