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1、肺炎支原体 IgM 抗体检测试剂盒 （酶联免疫法） 本试剂盒用于人血清或血浆中肺炎支原体 IgM 抗体的定性检测。 注册证号：国食药监械（进） 字 2010 第 3401015 号 病人标本中的肺炎支原体 IgM抗体与包被在微孔板聚苯乙烯表面上的肺炎支原体抗原结合。用洗涤液洗去多余的患者标本，加入与辣根过氧化物酶结合的羊抗人IgM 抗体。洗去未结合的酶结合物，加入含有色原（TMB）的无色酶底物（H【产品名称】 通用名称：肺炎支原体 IgM 抗体检测试剂盒 （酶联免疫法） 英文名称：Mycoplasma Pneumoniae IgM EIA 【包装规格】 ：96 人份 /盒 【预期用途】 A.预
2、期用途 肺炎支原体 IgM 抗体检测试剂盒用于定性检测人血清或血浆中肺炎支原体特异性的 IgM 抗体。 阳性结果可辅助诊断急性肺炎支原体感染。 B.背景介绍 肺炎支原体是最小最简单的自我复制微生物，它完全没有细胞壁。肺炎支原体是引起无症状性、轻度或少数严重上呼吸道和下呼吸道感染的常见人类病原体。已经发现肺炎支原体感染占所有肺炎病例的15201 。肺炎支原体感染通常是地方性的，可是每隔几年也会见到小规模的流行高峰1。肺炎支原体的传染性较弱，主要感染儿童、青少年和免疫抑制的成年人2 。 由于肺炎支原体没有细胞壁，因此常用的 内酰胺类抗生素对它没有作用。因此，正确诊断是调整治疗方法以缩短病程的基础。
3、血清学被广泛用于常规检验科检查。如果在间隔大约23周采集的标本中检测到IgG 和或IgA 类抗体水平显著变化，或在其中一个标本中检测到阳性IgM 类抗体，即可诊断为急性肺炎支原体感染。 表面暴露的P1 或 168kDa 蛋白是肺炎支原体的主要致病因子3-5。它是一种粘附素蛋白，感染时可引发免疫应答。相反地，在带菌阶段通常观察不到此蛋白的抗体4 。 Ani Labsystems 肺炎支原体 IgG、 IgA 和 IgM 酶联免疫检测使用了带有 P1 片段的抗原凝集技术以保证高度敏感性和特异性5 。 建议与 Ani Labsystems 肺炎支原体 IgG 和 IgA 酶免检测联合使用进行检测。
4、【检验原理】 Ani Labsystems肺炎支原体IgM 酶联免疫检测试剂盒的原理基于以辣根过氧化物酶作为标记酶的间接固相酶联免疫测定。根据下列反应进行测定。 2O2）。酶与色原反应生成有色终产物。加入酸（H2SO4）终止显色反应。颜色强度与患者标本中的肺炎支原体抗体浓度成正比。 【主要组成成分】 A.主要组成成分： 1.微孔板，128孔 包被好的微孔板。 2.样本稀释液，140毫升 磷酸盐缓冲液，含有专利商品添加剂、蓝色显色剂和0.05Bronidox作为防腐剂。 2a.肺炎支原体IgG去除剂，15毫升 抗人IgG ，溶于含有添加剂和 0.05Bronidox作为防腐剂的磷酸盐缓冲液。 3
5、a.阴性对照品，2.0毫升 肺炎支原体抗体阴性的稀释人血清，含有作为防腐剂的 0.05Bronidox和红色显色剂。 3b.临界值对照品，2.0 毫升 肺炎支原体 IgM 抗体处于临界值的稀释后人血清，含有作为防腐剂的 0.05Bronidox 和红色显色剂。 3c.阳性对照品，2.0 毫升 含有0.05Bronidox作为防腐剂和红色显色试剂的人稀释血清。 4.酶结合物，30毫升 缓冲盐溶液，含有专利商品添加剂、红色显色剂、与辣根过氧化物酶结合的抗人IgM（羊）和作为防腐剂的0.1N甲基异噻唑酮。 5.TMB底物溶液，即用型, 18毫升 含有专用商品添加剂和0.01凯松作为防腐剂的3,3,5
6、,5四甲基联苯胺和过氧化氢柠檬酸缓冲液。 6.终止液，25毫升 0.45 M H2SO47.洗涤液，100 毫升 浓缩的柠檬酸缓冲盐水、含有专有添加剂和作为防腐剂的0.05Bronidox。 微孔板贴膜 2个 试剂槽 6个 注：试剂应保存在 +2 +8下。 每个组分的标签及包装上均印有效期。 避免不必要的光照，主要是预防试剂受光影响，因为酶结合物及 TMB 底物溶液都是光敏感试剂。 不同试剂盒中的以下成分可以通用： 洗液、 TMB 底物溶液、终止液 B.需要但未提供的材料 蒸馏水或去离子水，最好是无菌的。 用于稀释试剂的刻度量筒。 保存稀释试剂的试剂瓶。 精密加样器（比如：单道量程为0.5 1
7、0ul 、 550ul、20200ul、1001000ul 和多道50300ul ）。 纸巾或吸水纸。 定时器，至少可测60分钟。 微孔板恒温孵育箱。 酶标仪。 洗板机。 次氯酸钠溶液，游离有效氯为50500 mg/l 。 一次性手套。 C.实验中各组份的准备 试剂 准备 打开 /稀释后试剂的稳定性（+2-8） 包被好的微孔板 即用型 6个月） 样本稀释液 即用型 6个月） 肺炎支原体 IgG去除剂 即用型 6个月） 对照品 即用型 6个月） 酶结合物 即用型 6个月） TMB 底物溶液 即用型 6个月） 丢弃试剂槽中未使用的试剂。底物中出现深蓝色表明溶液已被污染，必须丢弃 终止液 即用型 6
8、个月） 浓缩洗涤液（10X ） 用蒸馏水1+9 稀释（1：10）+4下一个月，室温下一个星期）由铝箔包装的微孔板在打开后，应该和干燥剂一起密封保存在+2-8 ，下，将其开口密封好。开封试剂只有在+2-8 ，正确的保存条件下，它们才可保持好的稳定性，高的环境温度和污染可降低试剂的稳定性。 【储存条件及有效期】 本试剂盒储存于+2-8 ，有效期 18 个月。 【适用仪器】 A.该试剂盒适用于各种酶标仪 【样本要求】 血清和血浆标本采集后应冷藏（4），如果不能在一周内进行试验，标本应冷冻（20或70中各适合的温度下）。标本不应反复冻融。 由于叠氮化钠可使辣根过氧化物酶失活，因此不要使用叠氮化钠作为防
9、腐剂。 血清或血浆的热灭活（56，30分钟）可能引起非特异性结果。 如果被微生物污染、严重溶血或高脂的血清和血浆，可能产生错误结果。 长期保存血清（冷冻超过一年）可能导致形成脂质聚集物。这些聚集物可能引起非特异性结果。 【检验方法】 A.实验前的控制与操作 在实验开始前，将试剂和微孔板平衡至室温（+2025）。 并将孵育器预热至 37。 B.实验设计 样品分配方案如下所示： 微孔板 图例： BLK空白 NC 阴性对照 PC 阳性对照CO=临界值对照 S 样品 C.检测方法步骤 (一 ) 试验准备： 1.试剂盒取出后在室温下放置 20-30 分钟，使其恢复到室温。 2.配制洗涤液：浓缩洗液（ W
10、ASHING SOLUTION 10X）用酶免级用水进行 10 倍稀释，（1+9 ） (二 ) 试验操作 1.将样本用样本稀释液进行 1：101 稀释（5ul 样本+500ul 样本稀释液）。 2.吸取 100ul 样本稀释液（2 号瓶）作为试剂空白 3.吸取 50ul 的 IgG 去除试剂（2a 瓶）加入到每个样本孔中，然后在样本孔中加入 50ul 的稀释好的样本（最后稀释比为 1：202）。混匀 4.向对照品孔内加入即用型的对照品 100ul（3a、3b和3c瓶） 。一式两份 5.用封口箔封好微孔板，在 37孵育 60 分钟。 6.洗板。每孔加入 300-400ul 洗液，洗 5 次，每次
11、间浸泡 15-30 秒。 7.除空白孔外，每孔加入 100ul 的酶结合物。 8.用封口箔封上后在 37下孵育 60 分钟。 9.洗板。每孔加入 300-400ul 洗液，洗 5 次，每次间浸泡 15-30 秒。 10.每孔中加入 100ulTMB 底物溶液，室温下（+2025）避光孵育 30 分钟。 11.每孔中加入 100ul 硫酸终止液。 12.在 450nm（主波长）和 620nm（副波长）处读取吸光度值。 注意： 为了提高效率和精密度，建议使用 8 通道加样器。 1.用样本稀释液对样本进行 1：101 稀释（5ul 的样本加入到 500ul 样本稀释液中），混合均匀。临界值对照须加两
12、个样本孔。稀释后的样本在 4下至少可以稳定 1 周。对照品不要进行稀释。不要向对照品孔和空白孔内加入除 IgG 试剂。 2.避免污染：当从试剂瓶中吸取液体时，要运用无菌技术以避免污染。每一份样本在吸取时都要使用新的吸头。将 4 所需的样本稀释液、酶结合物、TMB 底物液加入 5 次性的试剂槽中（试剂盒内提供6 个） 将未用完的液体丢弃，不要将其倒回原瓶内。 当加底物时，加样器头部要与微孔壁接触。 3.洗涤时可以手工操作或者用洗板机进行。在洗涤后，将微孔板在纸巾上将水拍干。 4.在 450nm 处以空气调零，参考波长是 620nm（590-690nm） 。大多数的微孔板读数仪可以自动地扣除试剂空
13、白。样本的吸光值可以自动地扣除试剂空白。然而，试剂空白的吸光值应该在指控范围内。 注意：所有的肺炎支原体、肺炎衣原体、百日咳杆菌的IgG 、 IgA、 IgM抗体可以用相同的稀释样本来进行检测，这样在实验开始时用肺炎支原体或百日咳杆菌检测试剂盒内的样本稀释液对样本进行稀释是非常重要的。详细的情况看试剂盒的说明。 【参考值范围】 结果计算 结果以吸光值 临界值（SCO ）单位表示。 用下列公式计算： SCO标本 （A 标本 A 空白 ） （A 临界 A 空白 ） 其中A 标本 标本的吸光度 A空白 空白孔的平均吸光度 A临界 临界对照品的平均吸光度 S/Co 结果 1.1 阳性 【检测结果的解释
14、】 A. 判断标准 当满足以下条件时，测定的结果可被接受： 吸光值 空白 阴性对照 临界值对照 0.100 0.150 *) 0.250*) 阳性对照 0.850-2.000*) ）已经从这些值中减去了空白孔吸光度。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A BLK 1S B BLK 2S C NC 3S D NC 4S E CO 5S F CO S6 G PC S7 H PC S8 B. 结果解释 灰区 根据对大约500 名芬兰献血者血清和血浆标本进行分析以及计算 SCO值的分布参数，疑似区间为0.51.1 。换句话说，得出结果为0.5 1.1 S CO的标本被认为是可疑的，
15、应当用成对标本定时地重新测定以监测IgM 抗体的动态。 急性传染：阳性结果 原发急性感染时，第一份血清标本中已经可能检测到 IgM 反应。再感染时 IgM 可能保持阴性。Ani Labsystems 肺炎支原体 IgA 和 IgG 酶免检测为诊断急性肺炎支原体感染提供了辅助信息。 非急性传染：阴性结果 稳定或降低的IgG 和 或 IgA水平加上阴性或疑似的IgM表明可能存在以下一种感染：既往感染、近期感染、感染已愈或持续感染。 C. 疑难解答 空白太高 原因错误 解决方法 1、污染，其它孔有溢出液。 避免污染。 2、没有正确稀释浓缩洗涤液。 应该按 110 （1 9）稀释。 3、洗涤效果差。 检查洗板机。 4、试剂槽中的 TMB 底物溶液被污染。 保留剩余底物溶液直到完成试验。检查试剂槽中的底物是否变蓝。变蓝表明存在污染。 所有吸光度值均很低 原因错误 解决方法 1、孵育温度太低。 在 37 1下孵育。不同恒温箱的加热效率差异很大。最好使用加热效率高且加热均匀的恒温箱。 2、酶结合物被溅出的人血清污染 所有的吸光值均低。 只要少量的血清就足以阻断其活性，要特别注意防止污染。 3、溅出的人血清污染了微孔 只有少数几个孔的吸光值非常低，要特别注意防止污染。 4、试剂变质。 由于污染或酶结合物中的辣根过氧化物酶变质
