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1、1三硫化二砷纳米微球的扫描电镜观察和图像分析【摘要】 目的：对制备的砷类中药雌黄（三硫化二砷）纳米微球进行表征,为进一步探索纳米雌黄的抗癌机理提供实验基础。方法：（1）以砒霜、硫代乙酰胺、盐酸为原料，采用化学法制备雌黄纳米微球；（2）用扫描电镜、 X 射线能谱、图像分析系统对雌黄纳米微球进行分析表征。结果：实验制备的雌黄纳米微球电镜下呈圆形或椭圆形，分散性较好，图像分析系统示平均粒径为 440 nm。结论：采用化学法可制备雌黄纳米微球。 【关键词】 雌黄 纳米微球 表征砷制剂对肿瘤的治疗是近年来的研究热点，特别是对白血病的治疗为人们所关注。近年来，国内外学者在砷剂抗癌研究方面取得了可喜的成就1
2、3 ，大量的临床实践和基础研究已证明含砷类中药在肿瘤治疗方面有广阔的应用前景。但传统砷制剂的临床应用目前仍存在不少问题，如毒副作用大、颗粒偏大、生物利用度较低等。本研究采用化学合成法制备三硫化二砷（As2S3，雌黄）纳米微球，并对其相关特性进行扫描电镜观察、能谱和图像分析。1 材料与方法211 主要试剂与仪器As2O3（ Sigma 公司） ；传统 As2S3 粉末（上海化学试剂采购公司，纯度为 97%） ；硫代乙酰胺（TAA，国药集团化学试剂有限公司，分析纯） ；37%盐酸（南京化学试剂一厂，分析纯） ；无水乙醇（上海宏图化学试剂厂，分析纯） ；扫描电镜（JEOL JSM6360LV，日本）
3、 ；能谱仪（Thermo NORAN，vantage ，美国） ；CMIAS98A 图像分析系统（北京航空航天大学） 。12 As2S3 纳米微球制备配制一定浓度的 As2O3 盐酸溶液。量取一个体积去离子水，在磁力搅拌下分别向其中加入等量的上述 As2O3 盐酸溶液。精确称取配方量的 TAA，使之溶于适量的水中，在磁力搅拌下取 TAA 溶液滴加至上述反应体系中，滴加完毕后继续搅拌数分钟，分别水浴至溶液变浑浊。次日滴铜网 1 张后离心，弃上清，去离子水洗涤，适当温度烘干。13 As2S3 纳米微球的电镜形态学观察和能谱表征取出少量自行研制的 As2S3 纳米粒胶体溶液，滴有膜铜网，晾干，制得电
4、镜样品，在 JEM2010 扫描电镜下随机选几个视野观察3拍照，同时用射线能谱仪（EDS）对自制的 As2S3 纳米粒进行元素成分及其含量分析，以检测 As2S3 纳米粒的组成。检测条件为Accelerating voltage: 200 keV; Take off angle: 3.94519; Live time:174 seconds; Dead time: 66.23 seconds。同时对传统的雌黄粉末进行观察比对。14 As2S3 纳米微球平均粒径的图像分析制备的 As2S3 纳米微球经无水乙醇超声分散后用扫描电镜拍照，而后将照片用图像扫描仪扫描并输入计算机中，CMIAS98A 图
5、像分析系统进行图像分析，计算平均粒径和圆度等指标。2 结 果传统的 As2S3 粉末在扫描电镜下呈多边形或不规则晶体状，直径大小约为 5 m 或更大（图 1） 。制备的 As2S3 样品外观呈黄色，扫描电镜显示 As2S3 纳米微球基本呈圆形（图 2） 。EDS 测试结果（图 3）显示样品中只有 As、S 两种元素，S、As 质量百分比分别为 42.81和 57.19。图像分析仪粒径统计学分析结果显示，As2S3 纳米微球的平均直径约为 440 nm。见表 1。3 讨 论4近年来，随着纳米技术的研究进展，在纳米水平上研制纳米微球载体和药物引起了人们的广泛重视，从而诞生了纳米药物这一新概念，也为
6、中药现代化开辟了新途径。目前，第 4 代靶向给药系统已成为药物新剂型研究中最活跃的领域之一，属于靶向给药系统的制剂主要有微囊（微球） 、脂质体和纳米粒等。纳米微球等纳米药物是指其粒径在 100 nm 左右、通常小于 500 nm 的药物制剂。纳米药物与常规药物相比，它颗粒小、表面反应活性高、活性中心多、催化效率高、吸附能力强，因此它具有许多常规药物不具备的优点，其主要作用在于能提高生物利用度；呈现新的药效，拓宽原药的适应证；丰富中药的剂型选择；增强靶向性，减少用药量，降低毒副作用，节省中药资源4。砷制剂作为目前治疗肿瘤的新药物是近年来的研究热点，本研究小组已将传统的 As2O3 与某些磁性载体
7、通过一定的化学、物理方法结合制备成同时具有磁感应定位及磁感应升温作用的砒霜磁性纳米微球、砒霜磁性纳米脂质体等，还利用溶胶 凝胶法将传统的As2O3 制备成 As2O3 纳米粒，并进行了抗宫颈癌、乳腺癌、肝癌和卵巢癌等体内外实验研究。结果表明，As2O3 纳米粒和 As2O3磁性纳米复合物对肿瘤细胞的抑制和诱导凋亡作用均明显强于传统剂型的 As2O356。雄黄（四硫化四砷）同属于含砷矿物类中药，研究证实其对慢性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征等恶性血液系统疾病疗效显著。也有学者将雄黄制备成了纳米级颗粒，并且获5得了良好的疗效7。而雌黄为雄黄的共生体，雄黄和雌黄在山岩中总是形影不离，所以被人们称为
8、“鸳鸯矿物” 。雄黄的化学成分是As4S4，呈桔红色，故有“鸡冠石”之雅称。雌黄的化学成分是As2S3，呈略带绿的柠檬黄色。因此，可以根据不同的颜色区别二者。与雄黄相比，雌黄含砷量低、毒性小，但其临床应用和基础研究目前仅局限于颗粒较大的传统剂型，为了进一步改善剂型、提高药效、深入探讨含砷中药抗肿瘤作用及其作用机理，作者采用化学方法，以 As2O3 作为原料成功制备了 As2S3 纳米微球。从 EDS 的测试结果看，S、As 质量百分比为 42.81%和 57.19%，摩尔比接近于 32，组成应是 As2S3。通过扫描电镜观察，发现传统的 As2S3 粉末呈多边形或不规则晶体状，直径较大，在 5
9、 m 左右甚至更大。而制备的 As2S3 微球基本呈圆形，轮廓清晰，部分区域有聚集。通过图像分析仪检测出其平均直径为 440 nm，已基本达到纳米药物所要求的粒径大小，圆度为 1.1（圆度越接近 1 说明其越圆） ，由于圆度好，表面光滑，在临床上若用于血管注射，则不易损伤血管壁。实验表明，通过化学方法可成功制备雌黄纳米粒，为下一步的抗肿瘤实验奠定了基础。6【参考文献】1WANG Z Y, ZHANG D S, GU N, et al.Prepration and evaluation of arsenictrioxidenanoparticles for the treatment of hu
10、man liver cancer cells SMMC7721 in vitroJ.Journal of Southeast University(English Editor),2005,21(1):5862.2DU Y H,HO P C.Arsenic compounds induce cytotoxicity and apoptosis in cisplatinsensitive and resistant gynecological cancer cell linesJ.Cancer Chemother Pharmacol,2001,47(6): 481490.3郝红缨，滕智平，陆道培
11、.PMLRARa 及 RARa 融合蛋白在二硫化二砷诱导的 NB4 细胞凋亡中的作用J.中国实验血液学杂志,2002,10(2):108111.4王子妤,张东生. 纳米药物的研究进展J.东南大学学报:医学版，2004,23(2):131135.5张东生，贾秀鹏,樊祥山，等. 砒霜磁性纳米微球的研制及表征J.电子显微学报，2002,21(5):507508.6林梅,王子妤, 张东生.雌黄纳米粒的制备与表征J.电子显微学报,72005,24 (6)：604607.7DENG Y,XU H B,HUANG K X.Size effects of realgar particles on apoptosis in a human umbilical vein endothelial cell line：ECV304J.Pharmacological Research,2001,44(6)：513518.
