《PCR检验技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR检验技术（78页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、PCR (Polymerase Chain Reaction)检验技术,黑龙江中医药大学临床医学院 诊断教研室黄 萍,第一节 概述,一. 何为PCR？ PCR聚合酶链反应 英文全称 polymerase chain reaction 简称为PCR,第一节 概述,二 PCR的基本原理 PCR聚合酶链反应实际上是一种快速的特定DNA 片断在体外扩增技术。 简单的说： DNA的特性三步曲: 高温变性 低温退火 中温延伸 通过一个热循环仪（DNA扩增仪）将特异片断的基因(DNA.又叫模板DNA）在短时间内，经过引物Taq酶和三磷酸脱氧核苷酸（dNTPs）等作用后，放大到几百万倍。最后得到能肉眼看到的D
2、NA区带或可定量分析的DNA量。,第一节 概述,三 简单复习一下DNA的结构与复制 生命是由蛋白质合成的 蛋白质是由无数氨基酸连接成肽链而合成的 氨基酸则是由无数个基因即DNA组成的 这就是说DNA是蛋白质的生命,第一节 概述,DNA的基本构成单位： 脱氧核糖 核苷酸 磷酸 核苷酸有4种碱基： A腺嘌呤 T胸腺嘧啶 G鸟嘌呤 C胞嘧啶,第一节 概述,DNA的基本构成单位：C-胞嘧啶 ( G)A-腺嘌呤 (T)T-胸腺嘧啶 ( A)G-鸟嘌呤 (C)脱氧核糖磷酸氢键,第一节 概述,DNA的基本构成单位： 在DNA结构中，4种碱基，以AT、GC 进行严格配对的。 AT、GC排列顺序的变化是 无穷无
3、尽的。 人体中大约有30亿（3X109）DNA的基因组。 碱基的顺序是DNA的生命。,第一节 概述,RNA与DNA的区别： RNA的核糖是不脱氧的五碳糖 RNA的4种碱基是 A.U.G.C A腺嘌呤 U尿嘧啶 G鸟嘌呤 C胞嘧啶 U在DNA中对应的碱基是T（胸腺嘧啶）,第一节 概述,RNA与DNA的区别： 核糖 脱氧核糖,第一节 概述,碱基以3个为1组（三联密码）DNA ATG AAG AGT GTC CAT CAC TAAmRNA AUG AAG AGU GUC CAU CAC UAA蛋白质 甲硫氨酸 赖氨酸 丝氨酸 缬氨酸 组氨酸 组氨酸 无意义ATG（AUG）：起始密码，是转译的开始TA
4、A（UAA）：终止密码，是使1条肽链的合成到此中止。CAT（CAC） 简并密码，是一种氨基酸，可以有多于CAU（CAC） 1个的三联密码，但也是特定的。,第一节 概述,DNA与蛋白质合成的关系 用Watson和Crick的中心法则说明则是： 转录 翻译 DNA mRNA 蛋白质 逆转录,第一节 概述,DNA与蛋白质合成的关系 先由在细胞核中的DNA（基因）的碱基以3个为一组（三联密码）转录成mRNA的三联密码 mRNA来到细胞核外的核糖体（蛋白质合成的场所）上，且每一种三联密码指使一种特定的氨基酸同毗邻的氨基酸连接起来，变成了一种肽链（蛋白质）。这个过程称为转译。 如果合成的肽链很长的话，也可
5、以形成立体结构的蛋白质。,第一节 概述,DNA的结构： DNA大分子以反向互补的两条单链形成双螺旋的立体结构。其形状多少有点象人们常见的小食品“麻花”。,第一节 概述, DNA的复制 半保留复制 DNA的复制过程先是两个链分开，然后两条亲代链均以各自为模板，复制另一条互补链，之后再形成子1代的双螺旋结构，继之再以同样的方式复制成子2代、子3代、子4代。 此时把这种复制方式称为半保留复制。,第一节 概述,基因突变： 基因突变，也就是碱基的突变。 例如。ATG编码是甲硫氨酸，但如果发生了基因突变，是ATG中的T变成了A，则三联密码变成了AAG，在新合成的蛋白质长链上与甲硫氨酸对应的位置上就只能是赖
6、氨酸，而不再是甲硫氨酸了。这就是突变的本质。有时人体就因此发生病变。这也就是“突变”的主要实质。,第一节 概述,四 扩增HBVC基因片断为例 简述PCR原理 HBV病毒 是带有3182个碱基的双螺旋的双链DNA 步骤 1 前处理 2 基因扩增 3 电泳 4 检测报告,第一节 概述,基因扩增 模板DNAHBV病毒 950C 变性：使双链打开，变成两个单链，二个单链 是实验成败的关键 550C 退火：在合成原料d NTPs.Mg2+的作用下，模板DNA与引物 C 构成 二条杂交链,二条杂交链决定其实验的特异性 720C延伸：在Taq酶的作用下，以引物为起点，开始DNA链延伸反应，使链延长。形成一条
7、新的链 对实验的特异性和产量有关！ 生成二个特异性的DNA片断，完成了第一次循环 生成的二个特异性的DNA片断，继续进行下一次循环，经过25-30次循环，模板DNA得到了大量的复制。HBV-C可扩增到几百万倍。,第一节 概述,理论上讲，DNA的产量是指数方式增加，即n次循环后，扩增产物拷贝数为r=2n 但是应该指出，扩增产物的指数式增加不是无限制进行的。在PCR反应后期，由于引物和底物的消耗，Taq酶活力下降等因素的影响，扩增产物的增加逐渐由指数形式变为线性形式。所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106-107。 如果想提高扩增产物的产量，可将产物DNA样品稀释1000-10000倍
8、后，作为新的模板再进行第二轮PCR扩增。,第一节 概述, PCR 循环 - Step 1 - 热变性,第一节 概述, PCR 循环- Step 2 - 引物对 （Primer Pair）退火结合到靶序列,第一节 概述, PCR 循环- Step 3 - Taq DNA 聚合酶 催化引物延伸,第一节 概述, 第一个PCR 循环结束- 产生靶序列的两个拷贝 （Copies）,第一节 概述, 靶序列扩增,第一节 概述,上述的扩增是在PCR扩增仪上进行的。 然后将扩增产物经过EB电泳， 最后在紫外透射仪上进行鉴定、定量分析。,第一节 概述,第一节 概述,报告方式定性: PCR HBV-DNA + PC
9、R HBV-DNA -定量: PCR HBV-DNA 1.00X103copies/ml PCR HBV-DNA 1.00X103copies/ml,第一节 概述,第一节 概述,第一节 概述,五 PCR技术的特点（一）特异性高 1. 以探测基因为目标。属于“病因诊断”，针对性强。对多种传染病，根据PCR检测结果可以确诊。 2. 在感染性疾病的基因诊断中，不仅可以检出正在生长的病原体，也可检出潜伏期的病原体。既可确定既往感染，也可确定现行感染。 尤其对那些目前尚不能体外培养或难于培养的病原体（梅毒螺旋体、结核杆菌、乙肝病毒等）采用PCR检查来确定感染就特别有效。 PCR检测的靶样品是病原体的核酸
10、，与生物化学和免疫学检查相比，PCR结果与病原体分离培养结果更为一致，直接反应病原体的存在与否。,第一节 概述,（二）灵敏度高 在PCR扩增中，模板DNA以指数级迅速增加，样品中极其微量的靶序列在数小时内即可增加上百万倍，因此检测灵敏度高。 ELISA（酶联免疫吸附试验） 灵敏度高 ng RIA （放射免疫分析） 灵敏度高 pg PCR （聚合酶链反应） 灵敏度高 fg 理论上可检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在。可利用单一双倍体细胞。一根头发、甚至单一精子进行DNA定型。 从而提高临床诊断的阳性率和准确率。,第一节 概述,（三）简便快捷 有了扩增仪，有了商品化试剂盒，操作者不必自配
11、各种试剂，只需将样品作简单处理和加样后，仪器即可自动循环进行扩增。许多PCR检查现在在数小时左右即可出报告。,第一节 概述,（四）对样品要求低 几乎所有的临床标本都可用于PCR扩增。 甚至低温保存多年的陈旧标本。 PCR检测病原微生物，并不要求标本中有存 活的病原体。病原体虽然失活，只需有完整 的靶序列核酸，PCR就可以检出来。 一些过去靠脑脊液，脊髓检查的项目PCR以 其高灵敏度和高特异性，从检查血、唾液或 尿标本同样可以得到一致的结果，为标本采 集带来方便，也使检测范围扩大和容易展开。,第一节 概述,(五) PCR的局限性 由于Tag酶缺乏3- 5端的外切酶活性，因而不能纠正 反应中发生的错误的核苷酸掺入，使PCR扩增产物有一 定程度的错误掺入。 但是错误掺入的碱基有终止链延伸作用的倾向，这 使得发生了的错误不会进一步扩大。 PCR由于高敏感性容易导致交叉扩增。在实验室污染的 情况下可能出现假阳性结果。,
