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1、绵羊卵巢组织石蜡切片制作条件优化研究姜晓龙陈建伟姚晓磊赵妙妙吕丽华(山西农业大学动物科技学院山西太谷 030801 )【摘要为观察绵羊正常卵巢组织的形态结构，采用苏术精一伊红(hcmatoxylirrcosin, HE)染色法制作绵羊卵巢组织石蜡切片。结果显示，在切片制作过程中存在的问题主要包括染色不均、染色对比不明显、过度染色、染色过浅和切片出现斑点等。在试验过程中可通过充分分化、蓝化、充分水洗等因素的控制来提高切片的染色效果，该方法可为动物卵巢及卵泡染色切片制作提供技术指导。关键词:绵羊;HF 染色;卵巢;切片;优化HF 染色法是石蜡切片技术中常用的染色法。苏术精碱性染液可使细胞核内染色质
2、与胞质内核糖体着蓝紫色;伊红酸性染料可使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，作为组织学、月王胎学、病理学教学与科研中最基木的技术方法而被 一泛使用川。木试验通过 HF 染色技术制作石蜡切片，该方法是一种多步骤、多因素决定的过程，在试验中由于操作不当，经验不足，以及实践的使用和时间的掌握等诸多因素影响，出现切片脱落、染色不均匀、糊不清、褶皱，及细胞核和细胞质对比不明显等现象，从而影响使用效果。HF 染色切片制作过程中出现的问题进行了探究，并提出解决方案，这对相关的试验操作具有指导意义。1 材料与方法1. 1 试验材料木试验选用山西省清徐县屠宰场成年健康母羊，屠宰后取卵巢。1.2 主要试剂和仪器Yo
3、uin 氏固定液、包埋纸盒、染色缸、融蜡箱、切片机、恒温箱、载玻片、小烧杯、吸水纸、移液枪、盖玻片、石蜡，1%盐酸水溶液、0.500 伊红(水溶性)溶液、各梯度的乙醇、二甲苯、苏术精染液、伊红染液、中性树胶、蒸馏水。1. 3 试验方法1. 3. 1 绵羊卵巢的处理:将卵巢投入预先配好的固定液中(1000 福尔马林，Youin 氏固定液等)，使组织蛋白质变性并防I I 几细胞死亡后自溶或细菌分解。1.3.2 脱水透明:用低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织中的水分，再将组织块置于二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的酒精，才能浸蜡包埋。1. 3. 3 浸蜡包埋:将透明处理的组织块置于熔化的石
4、蜡中，放入熔蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。1. 3.通切片与贴片:将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成厚度为-8 pm 薄片。切卜的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放朽。C 恒温箱中烘干川。1. 3.脱蜡染色:染色前，用二甲苯门)脱蜡 5min，入二甲苯 Ul中脱蜡 10min，用吸水纸吸干液体 ;入 100%乙醇 U)smin，入 100%乙醇门 1) 5min，用吸水纸吸干液体 ;入 9500 乙醇 3 min 并过流水 2 min，用吸水纸吸干水分。苏术精染色 -8 min ，并用 1%盐酸水溶液分化 5-10s，自来水洗返蓝 15-30 min;0. 50
5、0 伊红(水溶性)染色 30 s,95%乙醇门脱水 5 min，用吸水纸吸干液体 ;95%乙醇门 1)脱水 5 mln，用吸水纸吸干液体;入 100%乙醇门6 min,100%乙醇ll 2 min,用吸水纸吸干液体入二甲苯1)中透明 2-3 min，二甲苯 Cll)中透明 5 min。用移液枪吸取适量中性树胶于载玻片上，盖上盖玻片待凝固后观察结果。2 结果与分析2. 1 正常染色经显微镜观察，正常 HF 染色切片见图 1-A,l-B。图 1-A 可见卵巢上有腔卵泡的存在，图 1-B 可见卵巢卵泡颗粒细胞(GCS、内膜细胞 CTC)的细胞核呈蓝紫色;而周围的细胞质、纤维被染成粉红色，切片染色均匀
6、无褶皱，细胞核和细胞质对比明显。2.2 染色异常在切片制作尤其是染色过程中常会出现染色异常情况，从而影响了正常的组织形态观察。图 1-C 显示细胞核染色苍白、暗淡，细胞核与细胞质染色对比度差。出现这类问题有三种原因:切片在苏术精染液停留时间太短;苏术精染液过度氧化，失去染色能力; 分化步骤处理时间过长。可进行切片重新染色。如果组织在酸性固定液Zcnkcr,Bouin及非中性缓冲甲醛液固定时间过长，细胞核染色能力将减弱，须增加其在苏术精染色液的时间，或用一些方法增加组织的嗜碱性，以改善细胞核的着色。图 1 - I显示细胞核过染，核膜、核仁等不清晰，细胞质含有大量的苏术精，导致细胞核与细胞质比例失
7、调。这主要是由于在染色过程中切片在苏术精染液停留过长、切片太厚、分化步骤时间太短，造成苏术精染液大量分布而占据细胞质位置。通过显微镜上卜微调观察，如果只有 1 - 2 层细胞核层次，说明不是因为切片太厚，可经脱色、漂白、重新染色，对染色和分化时间做些适当的调整。若是由于切片太厚导致的细胞核过染，则需要重新切片。图 1-F 显示细胞核呈红、棕色改变。这主要由于苏术精染色液过度氧化和切片在苏术精染液染色后返蓝不足。提示染色之前检查苏术精染色液的染色能力，发现氧化过度应及时更换;同时，可用流水、温水或弱碱性溶液如稀氨水、0.200 碳酸氢钠溶液等在苏术精染色后，给切片足够的蓝化时间。图 1-F 显示
8、伊红着色淡，切片中央区域伊红染色不均匀，可能为弱碱性溶液残留导致伊红拒染;也可能是蓝化液残留过多、切片太薄，或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。因此，在染色前应检查伊红染液的 pH 值，必要时可用乙酸将 pH 调节在. 6-5. 0 之间。在脱水时切片在低浓度乙醇停留时间不可过长，低浓度乙醇会将伊红的颜色分。化掉图 1-G 显示细胞质过染，分色不足，这是由于伊红深染导致细胞核与细胞质没有层次，缺乏对比。提示在染色前适当稀释伊红染液，减少伊红染色时间;切片在乙醇脱水步骤时，停留时间要相对均匀。图 1-H 显示切片中出现蓝黑色沉淀物，这主要是试验中使用的苏术精染液没有过滤处理，导致苏术精染液中的
9、金属膜熟附在玻片上。建议使用半氧化苏术精染色液，如 Gill 苏术精染液，可以避免金属膜的产生。图 1-1 可见切片内有大量水珠或云雾状改变，这是梯度乙醇处理后没有完全脱水造成的，因此，所有用于脱水和透明的液体，在使用一定时间后应及时更换。图 1-J 显示由于组织切片脱蜡不彻底或分化液浓度过大、分化后没有迅速入水终 i1=分化，导致切片染色不均，出现“阴阳脸” ，出现这种情况需要重新取材制作切片图 1-K 显示镜检时切片中出现大片白色斑点，这是由于脱蜡不彻底，染色液因石蜡斑点的残留不能渗透组织着色。因此，脱蜡时切片在二甲苯中停留时间相对延长或更换二甲苯，脱色、漂白、重新染色。3 讨论在研究雌性
10、动物繁殖性能中，卵巢组织切片是较常用的用于了解动物卵巢结构与其年龄特征、生理功能、细胞凋亡、蛋白表达相关的常规技术。常青等(2001)为观察早期老年大鼠使用外源雌激素后卵巢结构及功能的变化，通过建立早期老年大鼠模型，采用放射免疫法测定使用外源雌激素后外周(fi.液中促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH),雌二醇(E)及辜酮(丁)水平，并通过卵巢组织切片观察卵巢结构的改变。结果发现，早期老年大鼠应用雌激素后外周血 FSH 明显降低，F 水平明显上升，丁水平明显降低;同时卵巢门细胞减少，卵巢基质相对增生。土朝清等(2006)为探索家兔卵巢典型结构与其年龄的关系，选取不同年龄段的家兔卵巢，常规石蜡切片
11、，HE, Vnaicson 和 PAS 染色，镜检并计数各级卵泡。结果表明，2 月龄的家兔卵泡开始发育，随年龄的增长发育程度逐渐增强。 - 5 月龄卵巢的皮质、髓质分界清楚，未见黄体、闭锁卵泡及间质腺，发育中卵泡由周围向中央排列，与人的卵巢结构较为相似。7-8 月龄卵巢结构呈性成熟状态，卵巢髓质随着家兔月龄增长间质腺逐渐增多川习。陈华絮等(2007)针对常规石蜡切片制作步骤琐、耗时长，试验中所用二甲苯对人体有较大危害的缺点，探讨提高兔卵巢组织石蜡切片质量的制作方法，研究从脱水和透明环节进行技术优化，用正 J 醇与无水乙醇混合溶液取代常规的脱水剂和透明剂。该混合液具有较好的脱水和透明作用。镜检结
12、果表明，卵巢组织结构清晰可辨、对比度好、层次分明，组织切片镜检效果良好，具有工序简单、质优、省时和实用性较好等优点2 习。杨轩(2009)对家兔卵巢石蜡切片 HF 染色过程中影响因素进行了研究，在试验过程中通过改变条件进行比较试验，重点分析了染色过程中温度、时间、切片厚度等因素对镜检效果的影响。木研究通过对绵羊卵巢组织切片的制作，并通过镜检效果重点对影响 HF 染色的因素如切片厚度、染液 pH 值、染色时间、分化、蓝化等进行分析探讨，对试验中影响镜检效果的相关因素进行了解决并加以优化，这对相关动物卵巢常规切片的制作具有一定的指导意义。参考文献C1刘 ill_新.实用生物组织学技术M.北京科学出
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