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1、1什么是 siRNA 和 RNAi双链 RNA 经酶切后会形成很多小片段,称为 siRNA,这些小片段一旦与信使 RNA(mRNA)中的同源序列互补结合,会导致 mRNA 失去功能,即不能翻译产生蛋白质,也就是使基因“沉默”了。RNA 干扰(RNAinterference ,RNAi)是由双链 RNA 引发的转录后基因静默机制,它通过生物体内 siRNA 介导识别,特定 RNA 水解酶参与,并靶向切割同源性靶 mRNA。实现 RNA 干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前 RNA 干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系
2、的研究。随着研究的不断深入,RNAi 的机制正在被逐步阐明,大量的论文被发表,成百上千的专利被授权或递交申请,而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景,RNAi 也越来越为人们所重视。RNAi 技术发展历程1998:植物基因中基因沉默现象的发现2000:哺乳动物细胞中基因沉默的实现2001:被科学评为当年十大科技突破之一2003:动物体内观察到 RNA 干扰作用2004:在恒河猴上的 SARS 病毒研究取得进展2004:Acuity Pharmaceutical 第一个 RNA 干扰药物申请 IND 2004:siRNA Therapeutics 第一个 RNA 干扰药物
3、申请 IND 2005:第一个 RNA 干扰药物进入一期临床,取得良好的效果2005:化学修饰的 siRNA oligo 体内系统给药取得突破2006:诺贝尔医学奖授予两美国 RNAi 技术专家2007:美国卫生研究院(NIH)组建首个 RNAi 委员会,旨在为 NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估截止 2008 年:已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验,其中,有一项药物已经推入到第 III 期临床试验RNAi 2006 诺贝尔医学奖述评 年轻的获奖者 2006 年 10 月 2 日,现年 47 岁的 Andrew Z. Fire 和 45 岁的 Craig
4、 C. Mello 由于在 RNAi(RNA interference,RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者,且获奖日期距其研究发表仅 8 年时间,获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价:“他们发现了控制基因信息流通的基本机制, 解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘,然后一切都一目了然了”。 RNAi 的殊荣 2001 年,随着人类基因组测序的完成,针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内,科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21 世纪科学发展史上的里程碑” 、 “生物学领域最
5、重要的成就之一”。然而时隔不久,同一年在哺乳动物中发现的 RNAI 掀起了一场风暴,而且愈演愈烈。Science杂志将 RNAi 称为“2002 年的重大突破”(Couzin,2002)。然而,更加令人吃惊和兴奋的是,4 年以后的今天,Andrew Fire 和 Craig Mello 就因此获得 2006 年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定,此前是绝无仅有的,这也足见 RNAi 在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。2 RNAi 的机制 RNAi 的身世 科学家们最早在植物(Napoli 等,1990)和脉孢菌(Neurospora crassa) (
6、Cogoni 和 Macino,1997)中发现了 dsRNA 诱导的 RNA 沉默现象。RNAi 在这些机体中作为抗病毒的防御体系而发挥作用。虽然在上述发现中,转基因病毒可以编码具有沉默功能的基因片断,并在复制过程中产生 dsRNA,但针对 RNA 沉默现象的决定性发现还是由 Andrew Fire 和 Craig Mello 首先完成的。早在几年前,在线虫中进行反义 RNA 实验时,Guo 和 Kemphues 就观察到正义RNA 也具有很高的基因沉默活性(Guo 和 Kemphues,1995)。后来 Andrew Fire 和 Craig Mello 通过实验阐明了这一反常现象:将反义
7、 RNA 和正义 RNA 同时注射到秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)比单独注射反义 RNA 诱导基因沉默的效率高 10 倍。由此推断,dsRNA 触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶 mRNA 水平(Fire 等,1998)。人们将这一现象命名为 RNAi (见综述: Arenz 和 Schepers,2003)。基因所携带遗传信息(即单个基因的具体功能)的传递是通过名为信使 RNA 的分子进入细胞蛋白合成“工厂” 而实现的,而基因功能的研究方法一直是研究工作的拦路虎。Fire 和 Mello 通过线虫实验证实:某些分子触发了特定基因上 RNA 的破坏,导致蛋白无
8、法合成,出现 “基因沉默”,而这一过程便被称为 RNAi。天然的 RNAi 现象存在于植物动物和人类等真核生物的体内,在调解基因活力和预防病毒感染方面起到重要作用。同时他们还发现了有效关闭基因表达的方法,这样当某一特定基因被“沉默” 后,其功能便反向的体现出来了。 RNAi 的运用 RNAi 主要通过在转录后(post-transcriptional) 水平阻断基因的表达,并借此研究基因的功能。同时它为我们提供了一个治疗疾病的新途径。比如,我们可以按拟定的方式来关闭(shutting off)非必需或致病基因的功能。从理论上说,若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明,可以通过
9、 RNAi 的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默 ”;病毒性疾病,眼疾,心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中;这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路。随着人们对多种生物体基因组序列了解的深入,RNAi 技术可以帮助我们更细致地了解复杂的生理学过程。RNAi技术与基因组学、蛋白质组学和功能蛋白质组学密切相关,因此, RNAi 本身可作为一项实验技术为生物工程及制药业等相关行业服务,从而在更深更广的领域发挥其作用。, RNAi 技术应用前景 研究基因功能的新工具 RNAi 能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的时间可以随意控制在
10、发育的任何阶段,产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕,发现大量未知功能的新基因,RNAi 将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势,近来 RNAi 成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多,标志着 RNAi 将成为研究基因功能不可或缺的工具。 研究信号传导通路的新途径 联合利用传统的缺失突变技术和 RNAi 技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系,Clemensy 等应用 RNAi 研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径 ,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果,在此基础上分析 DS
11、H3PX1 与 DACK 之间的关系,证实了 DACK 是位于 DSH3PX1 磷酸化的上游激酶。RNAi3技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好,克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点, 因此认为 RNAi 技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。 开展基因治疗的新策略 RNAi 具有抵抗病毒入侵,抑制转座子活动,防止自私基因序列过量增殖等作用,因此可以利用 RNAi 现象产生抗病毒的植物和动物,并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的 dsRNA 抵抗多种病毒。肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长
12、,而 RNAi 可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一区段序列的 dsRNA 分子,只注射一种 dsRNA 即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种 dsRNA 而将多个序列不相关的基因同时剔除。我们应该肯定 RNAi 技术在充满挑战的后基因时代必将有广阔的应用前景,它将会在生物医学研究中产生一种新的技术革命。人工合成的 dsRNA 寡聚药物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业。RNAi 基本原理目前对 RNAi 的作用机理尚不清楚, RNAi 是由 dsRNA 诱导的多步骤、多因素参与的过程,属于基因转录后调控,其中需要 ATP 的参与
13、。通常认为 dsRNA4由核酸内切酶(RNase )切割成 2123bp 的 siRNA(在果蝇 RNase 被称为 dicer),siRNA 再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)结合形成RNA 诱导的沉默复合物 RISC,然后 RISC 再特异性地与RNA 的同源区结合,通过酶的作用使RNA 降解,而产生基因沉默。靶RNA 被破坏后, RISC 还可以再作用于其它靶分子。siRNA 还具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于 30bp 的 dsRNA 可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKP)的激活而使其被降解,从而大大减少了
14、其对RNA 的抑制作用。RNAi 技术专用名词MicroRNA(miRNA,微小 RNA)一些小的双链 RNA 可以高效、特异地阻断体内特定基因表达,促使 mRNA 降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为 RNA 干扰(RNA interference ,RNAi ,也译作 RNA 干预或者干涉)。它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。mRNA,为 messenger RNA 的简称,或称为信使 RNA是由内源性发夹(hairpin)结构转录产物衍生而来的一种长为 19nt25nt 的单链 RNA。在每种高等动物中,存在 200 种以上的 miRNA,是最大的基因家族之一,约占基因组
15、的 1%。siRNA:(short/small interfering RNAs)mRNA 是由 DNA 经由转录而来,带着相应的遗传讯息,为下一步转译成蛋白质提供所需的讯息。小干扰 RNA 一种短片断双链 RNA 分子,能够以同源互补序列的 mRNA 为靶目标降解特定的 mRNA,这个过程就是RNA 干扰途径(RNA interference pathway)。 shRNAs:(RNA-Short hairpin RNAs)短发夹 RNA 是设计为能够形成发夹结构的非编码小 RNA 分子,短发夹 RNA 能够通过 RNA 干扰来抑制基因的表达。Thomas Rosenquists group
16、 和 Greg Hannons group 联合研究了在哺乳动物种系细胞中 shRNAs 的转移导致基因长时间稳定沉默的机制。cDNA:互补 DNA以信使 RNA 为模板合成的 DNA,常常采用互补 DNA 的一条链作为绘制物理图谱时的探针。Genomic Library 基因组文库5对某个染色体,制备随机产生的、相互之间有重叠部分的片段的克隆。RISC:(RNA-induced silencing complex)RNA 诱导沉默复合物在 RNAi 效应阶段,siRNA 双链结合一个核酶复合物从而形成所谓 RNA 诱导沉默复合物。激活 RISC 需要一个 ATP 依赖的将 siRNA 解双链的过程。激活的 RISC 通过碱基配对定位到同源 mRNA 转录本上,并在距离 siRNA3端 12 个碱基的位置切割 mRNA(3, 18, 27, 29)。尽管切割的精确机制现在还是未知,研究表明每个 RISC 都包含一个 siRNA 和一个不同于