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1、酶技术讲座一酶的概念（一）酶的生物学意义 酶是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质。酶的生理学意义：强的催化效能高度的专一性酶促反应没有副反应酶的催化作用是受调控的酶的化学本质是蛋白质，具有蛋白质的一切性质。（二）酶的化学本质 大多数酶是蛋白质1926 年美国 Sumner 脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质 1930 年 Northrop 等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质20 世纪 80 年代发现某些 RNA 有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些 DNA 也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。 某些 RNA 有催化活
2、性 1982 年美国 T. Cech 等人发现四膜虫的 rRNA 前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现 RNA 有催化活性 1983 年美国 S.Altman 等研究 RNaseP（由 20%蛋白质和 80%的 RNA 组成），发现 RNaseP 中的RNA 可催化 E. coli tRNA 的前体加工。 Cech 和 Altman 各自独立地发现了 RNA 的催化活性，并命名这一类酶为 ribozyme（核酶），2 人共同获 1989 年诺贝尔化学奖。 抗体酶（abzyme） 抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区（即肽链的 N 端
3、）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。 1986 年美国 Schultz 和 Lerner 两个实验室同时在 Science 上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。 有些 DNA 也有催化活性 1995 年 Cuenoud 等发现有些 DNA 分子亦具有催化活性。 （三）酶是生物催化剂1酶与一般催化剂比较（共性）用量少而催化效率高：细胞内含量少； 能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后本身不发生变化； 降低反应所需的活化能 2酶作为生物催化剂的特性 （1）高的催化效率 就分子比(molecular ratio)而言， 以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学
4、催化剂高 10710 13 倍，比非催化反应高 10810 20 倍。 （2）高的专一性（3）温和的反应条件（4）酶在体内受到严格调控：如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰调节、酶原活化等。 （5）酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关（四）酶的组成 1单纯蛋白质酶类 2结合蛋白质酶类全酶=酶蛋白+辅助因子（辅酶、辅基或金属离子）二 酶的命名和分类 1961 年国际酶学委员会（enzyme commission）提出的酶的命名和分类方法。 （1）标明底物，催化反应的性质 （2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，
5、水可略去。2习惯名称（recommended name）（1）底物 （2）反应性质 （3）底物，反应性质（4）来源或其它特点国际系统分类法 1分类:6 大类酶，氧化还原、转移、水解、 裂合、异构、连接注意顺序不能变！2编号: 用 4 个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“”隔开，前面冠以 EC（为 Enzyme Commission）。EC 类.亚类.亚亚类.排号，如 EC 1.1.1.1酶的分离、纯化及活力测定（一）酶的分离纯化1选材2破碎细胞3抽提4去核酸、去多糖5纯化6保存由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 :1全部操作在低温。 2在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3在提纯溶剂中加一些保护剂，
6、如少量 EDTA、少量 -巯基乙醇。4在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。（二）酶活力的测定 酶活力（enzyme activity, 也称酶活性）酶活力的测定1测定酶活力时应注意几点（1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed）（2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使SE。 酶的作用动力学（kinetics）（一）底物浓度对酶反应速度的影响 有关米氏常数说明几点 （1）K m 是酶的一个特征性常
7、数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关 （2）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的 Km 值，其中 Km 值最小的称该酶的最适底物。 （3）K m 除了与底物类别有关，还与 pH、温度有关， 所以 Km 是一个物理常数，是对一定的底物、一定的 pH、一定的温度而言的。（4）K m 与 Ks：K m 不等于 Ks，只有在特殊情况下即 和底物的亲和力。 （二）酶浓度对酶反应速度的影响1反应速度与酶浓度成正比 SE VE （三）pH 对酶反应速度的影响 1酶反应的最适 pH（optimum pH） 2pH 影响反应速度的比活力 酶活力蛋白质浓度原因 ( 1 ) pH 影响了酶分子、底物分
8、子和 ES 复合物的解离状态。 ( 2 ) 过高、过低的 pH 导致酶蛋白变性。（四）温度对酶反应速度的影响 1最适温度（optimum temperature） 最适温度与最适pH 一样，也不是一个固定的常数，它随底物的种类、浓度, 溶液的离子强度, pH, 反应时间等的影响。（五）激活剂对酶反应速度的影响 （六）酶的抑制作用和抑制作用动力学 1、不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 2、可逆抑制作用(reversible inhibition)及其动力学 （1）竞争性抑制作用（competitive inhibition） （2）非竞争性抑制作用（noncomp
9、etitive inhibition） （3）反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition） 酶的专一性及活性中心（一）酶的专一性（特异性，specificity） 1、绝对专一性（absolute specificity） 2、相对专一性（relative specificity） （1）基团专一性（group specificity） （2）键专一性 3、立体专一性（stereospecificity） （1）D-，L-立体异构专一性 （2）几何异构专一性 （3）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等 同的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。 酶的活
10、性中心（active center） 活性中心的概念 酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化作用直接有关，这个部位称酶的活性中心。组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有 Glu 和 ASP 的-COOH，Lys 的 -NH 2，His 的咪唑基，Ser 的-OH，Cys 的-SH，Tyr 的侧链基团。青霉素酰化酶1. 青霉素 G 酰化酶是由 亚基和 亚基组成的大分子蛋白质， 亚基分子量为 2025KD, 亚基分子量为 6065KD。活性中心在 亚基，但没有 亚基时，也没有活力。2. 青霉素 G 酰化酶在巨大芽孢杆菌、大肠杆菌、醋酸杆菌、粘性节杆菌和假单孢
11、杆菌等众多微生物中都存在。3.其活性中心为丝氨酸残基，不同来源的酶，其底物专一性明显不同，活性中心也不同。青霉素 G 酰化酶能特异性催化青霉素 6 位侧链酰胺基裂解形成 6-APA 和苯乙酸；还能催化头孢类抗菌素及其中间体 7-ADCA 的 7 位侧链酰胺基裂解。青霉素 G 酰化酶也能特异性催化6-APA 和 7-ADCA 与相应的侧链合成制备阿莫西林和头孢氨苄。4. 起初，人们使用溶液状态的酶用于催化裂解反应，但存在难以回收利用，成本高，易将酶混入最终产品，影响产品质量等问题。所以在 70 年代，人们将酶固定到载体上后在应用5. 提取：（1）巨大芽孢杆菌（2）大肠杆菌6.固定化：基本结构：聚
12、丙烯酸，聚甲基丙烯酸 。活性基团：环氧基或氨基7.杂酶：酯酶8.影响酶活力的因素：有机溶媒，苯乙酸，金属离子D氨基酸氧化酶D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase, DAO , EC 1.4.3.3）是以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的黄素酶，它广泛存在于哺乳动物人、鼠、猪、兔等的肝、脑、肾等组织器官中,也存在于微生物如藻类、曲霉、链孢霉、细菌、变形三角酵母、纤细红酵母、胶粘红酵母、假丝酵母等细胞内。不过具有广泛工业应用价值的的酶的来源是来自红酵母（ Rhodotorula gracilis）和变形三角酵母（ Trigonopsis variabilis ）的DAO（ RgDAO和
13、 TvDAO）。DAO 能特异性催化 D氨基酸的 氨基氧化脱氨基形成相应的 酮酸和氨。由于它对催化反应底物有高度的立体选择性,可广泛应用于生物传感器、D氨基酸的定量分析、L氨基酸和 酮酸的生产。分子量：39.3 或 42.6不同来源的 DAO 等电点有差异。主要杂酶：酯酶，内酰胺酶，过氧化氢酶影响酶活的主要因素：温度（低温和高温），重金属，Fe 2 和双氧水同时存在，染菌头 C 裂解中典型的副产物：7ACA亚砜，去乙酰头孢菌素衍生物，keto7ACA活性中心：精氨酸GL7ACA 酰化酶来自假单胞菌。 亚基分子量为 18KD, 亚基分子量为 58KD等电点：8.4，8.6活性：keto去乙酰7ACA 14， 头 C 1，keto7ACA 无影响活性的因素：PH 510 稳定，温度： 50 以下，戊二酸和醋酸（4060mM）能抑制 CAE和 GAC 活力，重金属主要杂酶：酯酶，内酰胺酶活性中心：ser
