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1、1环维黄杨星 D 对 Na2S2O4 诱导 EVC304 细胞损伤的保护作用作者：袁冬平, 许立, 龙军, 梁涛, 陶玲, 方泰惠【摘要 】 目的： 研究环维黄杨星 D(CVB-D)对 Na2S2O4诱导 EVC304 细胞损伤的保护作用。方法： 采用体外培养人脐静脉内皮细胞 EVC304，Na2S2O4 作为耗氧剂建立细胞缺氧损伤模型。用 MTT 法测定细胞存活率与细胞培养液乳酸脱氢酶（LDH）活力反映细胞损伤的程度，培养液一氧化氮合酶（NOS）活力与内皮素（ET）含量分析 EVC304 细胞的功能。结果： CVB-D 能显著抑制Na2S2O4 诱导 EVC304 细胞 OD570 的降低和
2、细胞培养液中 LDH活力的增加，提高培养液中 NOS 活性，降低 ET 的含量(与模型组比较，P0.05 或 P0.01)。结论： CVB-D 对 Na2S2O4 诱导EVC304 细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能与改善 NOS 和ET 失调有关。 【关键词】 环维黄杨星-D； 内皮，血管； 脐静脉； 乳酸脱氢酶； 内皮素；一氧化氮合酶Abstract Objective: To investigate the protective effects of cyclovirobuxine D （CVB-D）on human umbilical 2vein endothelial cell (
3、EVC304) from the injury induced by Na2S2O4 in vitro. Methods: Cell injury model of cultured EVC304 was induced by Na2S2O4 as oxygen comsuming agent. Cell injury degree was determined with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) stainning method.and lactate dehydrogenase (LDH) activity in culturing medium
4、. Cellular function of EVC304 was indicated by nitric oxide syntyhase (NOS) activity and endothelin (ET) content in the medium. Results: Cell survival ratio and NOS activity significantly decreased after treated with Na2S2O4, and the LDH activity and ET concents significantly increased (P0.05，P90%（H
5、PLC） 。尼膜同由德国拜耳公司生产，批号 CANAL2。 DMEM（LOW）是GIBCOBRL 公司产品，小牛血清是杭州四季青生物工程材料研究所产品，胰蛋白酶是 Sigma 公司产品。乳酸脱氢酶（LDH-L）试剂盒，中生北控生物科技有限公司，批号为 130021。一氧化氮合酶（NOS ）试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号 20050311。内皮素 ET RIA KIT，解放军总医院科技开发中心放免所，批号06120。41.3 细胞培养和实验处理 3ECV304 细胞置于低糖完全 DMEM 培养液中，隔天换液，23 d 传代 1 次，传 3 代后用于实验。当传代细胞生长良好时，用0.25%胰
6、蛋白酶-0.02%EDTA 消化，1 500 r/min 离心 5 min，洗涤 2 次，以细胞数为 1 105/ml 接种于 96 孔板，100 l/孔，在37、5%CO2 培养箱中培养。待其生长至单层融合后，换无血清低糖 DMEM 同步生长 24 h。 实验共分 6 组，对照组含 10%小牛血清低糖完全 DMEM 培养液，模型组含 10%小牛血清低糖完全DMEM 培养液，Nim 组含终浓度为 1 nmol/L 的 Nim-低糖完全DMEM 培养液；CVB-D 3 组的终浓度分别为 0.01 mol/L、0.1 mol/L 和 1 mol/L CVB-D-低糖完全 DMEM 培养液。各组培养
7、30 min 后，除对照组外，其余各组均加入终浓度为 1 mmol/L 的Na2S2O4 20 l 作用 2 h，吸去培养液，用 D-Hanks 液洗 2 次，然后加入无血清的低糖完全 DMEM 200 l，继续培养 24 h。1.4 细胞存活率的测定每孔加 5 g/L MTT 20 l，37 孵育 4 h，吸弃上清液，每孔加二甲基亚砜 100 l，振荡数分钟，用 DG3022A 型酶联免疫检测仪于 570 nm 测定细胞光密度 OD 值。并根据下列公式计算药物5对 Na2S2O4 引起的内皮细胞损伤的抑制率：抑制率（OD 给药组OD 模型组）/（OD 对照组OD 模型组）100%。1.5 L
8、DH、ET、 NOS 的测定收集加 MTT 前的细胞培养液，参照试剂盒说明检测LDH、 NOS,用放射免疫学的方法测定 ET。1.6 统计学分析所有数据以（xs）表示，用 SPSS12.0 统计软件包进行方差分析及 t 检验，P0.05 为有统计学差异，P0.01 为有显著性差异。2 结果2.1 OD570 值和 LDH 活力 Na2S2O4 作用于 ECV304 细胞后，模型组 OD570 值显著降低，培养液 LDH 活力显著增加，与对照组比较，差异显著。CVB-D 1 mol/L 和 0.1 mol/L 剂量组的 OD570 值显著升高，与模型组比较，差异显著。Na2S2O4 处理 ECV
9、304 细胞后，培养液LDH 活力显著增加，而 CVB-D 1 mol/L 和 0.1 mol/L 两个剂量6组均能抑制 Na2S2O4 诱导的培养液中 LDH 活力的增加，提示CVB-D 对 Na2S2O4 诱导的 ECV304 损伤具有一定的保护作用。见表 1。表 1 环维黄杨星 D 对 Na2S2O4 所致 ECV304 细胞损伤的影响（略）注：与对照组比较(1)P0.01；与模型组比较，(2)P0.05,(3)P0.01。2.2 NOS 和 ETNOS 与 ET 是反映内皮细胞生物学功能的重要指标。实验结果提示，经 Na2S2O4 处理后，ECV304 细胞培养液中 NOS 活力显著降
10、低，ET 含量明显升高，提示内皮细胞损伤。1 mol/L 和 0.1 mol/L 两个剂量的 CVB-D 能显著抑制 Na2S2O4 诱导的 ECV304细胞 ET 释放，提高 NOS 的活性（与模型组比较,P0.05 或P0.01） 。见表 2。表 2 环维黄杨星 D 对 Na2S2O4 所致ECV304 细胞 NOS 和 ET 的影响（略）注：与对照组比较，(1)P0.01；与模型组比较， (2)P0.05, (3)P0.01。3 讨论血管内皮在缺血再灌注损伤中起重要作用4。血管内皮细胞作为重要的内分泌细胞，可分泌多种血管活性物质，主要可分为两大类：一类是内皮源性舒张因子(EDRF) ，主
11、要包括 NO 等；另一类7是内皮源性血管收缩因子(EDCF) ，主要有 ET5。正常生理情况下，EDRF 和 EDCF 的平衡在保持正常血管张力、维持血管内皮的功能、维持器官的灌流、修复损伤及解除血管痉挛中起着重要的作用6。因此，阻抑 NO 与 ET 合成和释放的异常，对防止心血管疾病的发生发展具有积极作用。CVB-D 临床用于多种心血管疾病2，具有抗缺血再灌注损伤的作用7。本实验采用 LDH 释放和 MTT 比色法反映 CVB-D 对耗氧剂 Na2S2O4 诱导 ECV304 细胞损伤的保护作用。实验结果提示，CVB-D 能够保护缺血的内皮细胞。Na2S2O4 作用于 ECV304细胞后，培
12、养液中 ET 水平显著增加而 NOS 活力降低，表明血管内皮功能紊乱；而 CVB-D 可减少 ET 释放，增加与 NOS 活力，对缺氧损伤导致的内皮细胞功能失调有保护作用。这对于 CVB-D 在临床的应用是有指导意义的。综上所述，CVB-D 对耗氧剂 Na2S2O4 诱导 ECV304 损伤具有显著的保护作用，关于其保护内皮的分子生物学机制有待进一步研究。【参考文献】1 周玖瑶,孙毅东,邓素坚, 等.环维黄杨星 D 对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响J.中药新药与临床药理,2007(4): 285-289.82梁涛,方泰惠 ,姚秀娟,等.环维黄杨星 D 的药理研究进展J.解放军药学学报,2001
13、(1):35.3薛庆善. 体外培养的原理与技术M .北京: 科学出版社,2001:425-426.4Elizabeth M,Charles S.Mechanisms Underlying Acute Protection From Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury J.Physiol Rev,2008(88):581-609.5Endemann DH,Schiffrin EL.Endothelial dysfunction J.J Am Soc Nephrol, 2004(8):1983-1992.6Bousette N,Giaid A.Endothelinr-1 in atherosclerosis and other vasculopathiesJ.Can J Physiol Pharmacol, 2003(6):578-587.7许立,方泰惠 ,袁冬平, 等.环维黄杨星 D 对离体兔心缺血再灌注损伤的保护作用J.福建中医药, 2005(6):56-57.
