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1、1环孢素 A、维拉帕米、川芎嗪对胃癌多药耐药细胞株 SGC-7901/ADR逆转作用的研究作者：张娟 侯培珍 赵永峰 李翠文 曹瑞珍 王睿琦 高丽君【摘要 】 目的：探讨环孢素 A（CsA） 、维拉帕米（VP） 、川芎嗪（TMP）对胃癌多药耐药细胞株 SGC-7901/ADR 耐药性的逆转作用。方法：采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察 SGC-7901/ADR对化疗药氟尿嘧啶（5-FU）的耐药性，选择 CsA、VP 、TMP 的非细胞毒性剂量，并观察其与 5-Fu 联合对 SGC-7901/ADR 的逆转作用。结果：SGC-7901/ADR 对化疗药 5-FU 具有耐药性，相对耐药性(RF
2、)为 97.49；CsA 3.0mg/L、VP 10.0mg/L、TMP 300.0mg/L以下为 SGC-7901/ADR 细胞的非细胞毒性剂量，除 CsA 外，VP和 TMP 对 SGC-7901/ADR 的逆转作用呈剂量依赖关系；300.0mg/L TMP 较 10.0mg/L VP 逆转作用强（P0.01） ，使SGC-7901/ADR 相对耐药性降至 12.89，将 5-FU IC50 由13.001mg/L 下调到 1.542mg/L，逆转倍数是 8.43 倍。结论：SGC-7901/ADR 对 5-FU 具有耐药性，300.0mg/L TMP 是 SGC-7901/ADR 细胞多
3、药耐药性最有效的逆转剂。 【关键词】 胃癌；多药耐药；SGC-7901/ADR 细胞；逆转2Abstract Objective: To investigate the reversal effect of Cyclosporin A (CsA), Verapamil (VP), and Tetramethylpyrazine (TMP) against the multi drug resistance (MDR) gastric cancer cell line SGC-7901/ADR. Methods: MTT assay was used to assess the sensitiv
4、ity of SGC-7901/ADR cells to Fluorouracil (5-FU). CsA, VP, and TMP at non-toxic doses were separately applied together with 5-FU to examine potential reversal effect against SGC-7901/ADR cells by each agent. Results: SGC-7901/ADR cells are resistant to 5-FU with relative resistance (RF) of 97.49. Th
5、e non-cytotoxic dose limits for CsA, VP, and TMP are 3.0 mg/L, 10.0 mg/L, and 300.0 mg/L respectively. Both VP and TMP but not CsA exert dose-dependent reversal effect against SGC-7901/ADR cells with TMP at 300.0 mg/L exerting stronger reversal effect comparing with VP at 10.0mg/L (P0.01). At 300.0
6、mg/L, TMP reduces the RF of SGC-7901/ADR cells to the value of 12.89 and lowers the IC50 of 5-FU from 13.001 mg/L to 1.542 mg/L with a reversal fold of 8.43. Conclusion: Multi drug resistance cell line SGC-7901/ADR is resistant to 5-FU while TMP at 300.0 mg/l is the most effective reversal agent exa
7、mined here against SGC-7901/ADR cells.3Key words Gastric Cancer； Multi drug resistance (MDR)； SGC-7901/ADR cell； Reversal化疗在胃癌综合治疗中发挥着重要作用，但往往因为肿瘤细胞对化疗药物产生了多药耐药性（multidrug resistance，MDR）而疗效不佳1-2。解决 MDR 主要方法：一是寻找对 MDR 肿瘤细胞有效的抗癌药物，二是通过增加细胞内化疗药物浓度而逆转MDR。本试验旨在通过体外试验观察逆转剂 CsA、VP、TMP 对SGC-7901/ADR 细胞耐药性的
8、逆转作用，为胃癌有效的化疗提供理论依据。1 材料与方法1.1 人胃癌细胞系 人胃癌细胞株 SGC-7901、耐阿霉素药细胞株 SGC-7901/ADR 均由第四军医大学西京医院消化研究所惠赠。1.2 药物、试剂及主要仪器 TMP（北京永康药业有限公司） ，CsA（瑞士 Sandoz 公司） ，VP（上海禾丰制药有限公司） ，5-Fu（南通精华制药有限公司） ，阿霉素（ADM，汕头经济特区明治医药有限公司） ，RPMI1640 （美国 GIBCO 公司） ，新生小牛血清（杭州四季青生物研究所） ，MTT、DMSO、胰蛋白酶（美国4Sigma 公司） ，倒置显微镜（重庆光学仪器厂） ，酶标仪（美国
9、Biotek 公司） 。1.3 方法1.3.1 细胞培养 将 SGC-7901 细胞置于 10%新生小牛血清、100U/mL 青霉素、100g/mL 链霉素的 RPMI1640 培养液中。SGC-7901/ADR 细胞置于含 1.0g/mL ADM 的上述培养液中，37、5%CO2 饱和湿度孵箱内培养。SGC-7901/ADR 细胞实验两周前培养于不含 ADM 的培养液中。1.3.2 确定 SGC-7901/ADR 对 5-FU 的耐药性 采用 MTT 法，取对数生长期的 SGC-7901 细胞和 SGC-7901/ADR 细胞，以5104 密度接种于 96 孔板上，培养 24 小时。实验孔加
10、入不同浓度的 5-FU（10.0g/L105g/L ） （参照临床用量的血峰浓度设定实验药物浓度） 。每浓度设 5 个平行孔，培养 48 小时，加入20L（5.0g/L）MTT，4 小时后加入 DMSO 150L，摇床摇匀，以酶标仪 490nm 波长测定各孔吸光度（A 值） 。计算不同浓度下细胞的存活率3SR=（实验组 A 值/对照组 A 值）100% 、半数抑制浓度 IC50 及相对耐药性4(RF= 耐药细胞株 IC50/胃癌细胞株IC50)。51.3.3 确定 CsA、VP、TMP 的非细胞毒性剂量 方法同上，以 SGC-7901 细胞和 SGC-7901/ADR 细胞为靶细胞。设空白对照
11、组、阴性对照组、CsA 组(1.0mg/L、2.0mg/L 、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L)、VP 组(5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80.0mg/L)、TMP 组(100.0mg/L、200.0mg/L、300.0mg/L 、400.0mg/L 、500.0mg/L)，计算细胞在不同药物浓度下的 SR。1.3.4 观察 CsA、VP 、TMP 的逆转作用 采用 MTT 法，在SGC-7901 细胞和 SGC-7901/ADR 细胞中加不同浓度 5-FU(10.0g/L105g/L ） 、不同浓度 5-FU(10.0g/L105g/L)
12、+非细胞毒性剂量的“逆转剂” ，计算药物的 IC50 及逆转倍数 RI(RI=单独用药 IC50/联合逆转剂后 IC50)。1.3.5 统计学处理 采用 SPSS11.5 统计软件包进行回归分析、t 检验及方差分析，P0.05 认为差异有统计学意义。2 结果2.1 确定 SGC-7901/ADR 细胞对 5-FU 的耐药性 SGC-7901/ADR 细胞对 5-FU 具有耐药性，相对耐药性 (RF)为 97.49，见6表 1。表 1 不同细胞对 5-FU IC50 的影响（略）2.2 确定 CsA、VP、TMP 的非细胞毒性剂量 在 MTT 实验中，当 SGC-7901/ADR 细胞存活率 S
13、R95%5时，确定为本实验采用的非细胞毒性剂量，即 CsA 在 3.0mg/L、VP 在10.0mg/L、TMP 在 300.0mg/L 浓度以下。在此剂量范围内各种药物对 SGC-7901 细胞亦无明显细胞毒性作用，见表 2、表 3、表4。表 2 CsA 在不同浓度下对 SGC-7901/ADR 细胞存活率的影响（略）表 3 VP 在不同浓度下对 SGC-7901/ADR 细胞存活率的影响（略）表 4 TMP 在不同浓度下对 SGC-7901/ADR 细胞存活率的影响（略）2.3 观察 CsA、VP、TMP 的逆转作用 在非细胞毒性剂量范围内，1.03.0mg/L CsA 无逆转作用， VP
14、 和 TMP 对 SGC-77901/ADR 细胞的逆转作用呈剂量依赖关系（RVP=0.999，P=0.001；RTMP=0.972，P=0.001 ） 。300.0mg/L TMP 较 10.0mg/L VP 逆转作用强（P0.01） 。300.0mg/L TMP 能显著增加 SGC-7901/ADR 细胞对 5-FU 的敏感性（P0.05） ，使耐药细胞相对耐药性降至 12.89，5-FU IC50 由 13.001 mg/L 下调到 1.542mg/L，逆转倍数为 8.43 倍，是有效的逆转剂，见表5、表 6、表 7。表 5 CsA 对 SGC-7901/ADR 细胞耐药性的逆转作用（略
15、）*与 5-FU 组比较 P0.05表 6 VP 对 SGC-7901/ADR 细胞耐药性的逆转作用（略）*与 5-FU 组比较 P0.01表 7 TMP 对 SGC-7901/ADR 细胞耐药性的逆转作用（略）*与 5-FU 组比较 P0.01；与 5-FU+VP10 组比较P0.013 讨论8肿瘤产生 MDR 的主要机制是 P 糖蛋白（P glycoprotin，P-gp）及多药耐药性相关蛋白（multidrug resistence associated protein，MRP）的过表达 6，引起药物外流及细胞内药物积蓄减少。胃癌多药耐药细胞系 SGC-7901/ADR 对阿霉素、长春新
16、碱、丝裂霉素等多种药物具有耐药性7。本研究证实，SGC-7901/ADR细胞对 5-FU 同样具有耐药性，相对耐药性为 97.49。钙离子拮抗剂 VP 是第一个应用于临床的 MDR 逆转剂，可与细胞膜上的 P-gp 结合，有效逆转 P-gp 药物泵的作用，还可在mRNA 水平上抑制 P-gp 合成及活性，使化疗药物在细胞内浓度升高，细胞毒效应增强8。本实验结果显示，5.0mg/L 和 10.0mg/L VP 均可增加 SGC-7901/ADR 细胞对 5-Fu 的敏感性且呈剂量依赖关系。但在临床实践中，因其具有心脏毒性、神经毒性、骨髓抑制而限制了它的临床应用，故而逆转作用不能充分发挥。TMP 为中药川芎的主要有效成分，属酰胺类生物碱，目前认为它是一种新型的钙离子拮抗剂9。近年来发现，TMP 可通过多种途径对肿瘤起到治疗和辅助治疗的作用。本实验结果显示，1
