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1、1热休克蛋白 32 在脑缺血再灌注损伤中的作用作者：袁野 郭建增 杨俊卿 何百成 周岐新【摘要 】 目的 探讨热休克蛋白 32，即血红素加氧酶1（HO1 ）在脑缺血/再灌注(I/R)损伤中的作用。方法 实验用雄性级纯种 NIH 小鼠 75 只，随机分为假手术组、I/R 组、热休克I/R 组，每组 25 只。抽取并回输约 40%总血量加双侧颈总动脉夹闭20 min 建立 I/R 损伤模型。Western 印迹检测 HO1 蛋白表达；分光光度计法检测 HO1 和黄嘌呤氧化酶（ XOD）活性及丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量；TUNEL 法检测细胞凋亡。结果 热休克 I/R 组 HO1 表达（
2、0.310.007）和 HO1 活性（3 854.8293.8）pmolmg-1h-1） 高于 I/R 组（0.200.011 ，2 981.8212.7）pmolmg-1h-1 （P0.05） ；热休克 I/R 组细胞凋亡、XOD 活性、 MDA 和 ROS 含量低于 I/R 组（P0.05） 。结论 HO1 表达升高对脑 I/R 损伤具有保护作用，其机制与抗氧化应激有关。 【关键词】 热休克蛋白 32；脑损伤；缺血再灌注；氧化应激【Abstract】 Objective To investigate the effects of heat shock protein 32(heme oxy
3、genase 1, HO1) on brain damage 2induced by cerebral ischemia/reperfusion(I/R). Methods Cerebral I/R model was established by drawing out and reperfusing 40% of the whole blood volume in combination with clamping the carotid arteries for 20 minutes. The activities of HO1 and xanthine oxidase (XO)，the
4、 levels of malonaldehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS)，neuron apoptosis，and the expression of HO1 protein were determined by spectrophotometer，TUNEL method，and Western blot，respectively. Results The increased HO1 expression and HO activity was observed in heat shock I/R group (0.310.007),
5、(3 854.8293.8) pmolmg-1h-1, compared with those in I/R group (0.200.011), (2 981.8212.7) pmolmg-1h-1 (P0.05). The XO activity, MDA and ROS levels, as well as cellular apoptosis were lower in heat shock I/R group than those in I/R group (P0.05). Conclusions The upregulation of HO1 can protect neurons
6、 from the damage caused by cerebral I/R. The mechanisms may be related to the properties of HO1 against oxidative stress.【Key words】 Heat shock protein 32；Brain damage；Ischemia/reperfusion； Oxidative stress3脑缺血/ 再灌注（I/R）损伤是威胁中老年人健康的高危因素，目前尚缺乏有效的治疗手段1 。研究发现热休克蛋白 32，即血红素加氧酶1 （HO1 ）在脑内广泛分布,其表达可被 I/R 诱导
7、升高2 。离体实验研究显示,HO1 基因敲除神经元对氧化应激损伤敏感性增加，HO1 表达上调可增加神经元对氧化应激的耐受性 3，4 。然而近期有报告显示,HO1 过表达可加重多巴胺能神经元氧化应激损伤5 。显然脑氧化应激损伤时 HO1 表达增高的意义有待阐明。同时鉴于有关 HO1 在神经元氧化应激损伤中作用的研究多采用细胞体外培养模型完成，与在体情况有较大差距。本研究拟采用本室建立的 I/R 损伤小鼠模型6 ，以不同预处理干预 HO1 的蛋白表达和活性，观察 HO1 对 I/R 所致脑损伤的影响，探讨 HO1 在I/R 的作用和意义。1 材料与方法1.1 动物 雄性级纯种 NIH 小鼠 75
8、只，鼠龄 10 个月，体重2428 g（重庆医科大学实验动物中心提供） ，随机分为假手术组、脑缺血再灌注组（I/R 组） 、热休克 I/R 组，每组 25 只。1.2 方法41.2.1 主要试剂 6磷酸葡萄糖、氯化正铁血红素、还原型辅酶、6 磷酸葡萄糖脱氢酶、Pepstatin 和 Aprotonin（购自美国Sigma 公司） ；Leupeptin （购自美国 Amresco 公司） ；兔抗鼠HO1 多克隆抗体（购自美国 Oncogene 公司） ；BCA 蛋白定量试剂盒（购自美国 HyclonePierce 公司） ；原位细胞凋亡检测试剂盒（购自美国 Roche 公司） ；考马斯亮蓝蛋白定
9、量、活性氧(ROS)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、黄嘌呤氧化酶 (XOD)（试剂盒购自南京生物建成生物工程研究所） 。1.2.2 热休克模型 清醒小鼠置 42水浴环境中湿热 12 min（玻璃罩封盖导热容器，内部水深 2.5 cm） 。1.2.3 脑 I/R 模型 于热休克 16 h 后建立 I/R 模型。参照本室李梨6方法进行，简述如下：以 4 g/L 水合氯醛 400 mg/kg 腹腔注射麻醉小鼠，仰卧固定。手术分离双侧颈总动脉和右侧颈总静脉。以导管经颈总静脉向心脏方向插入，缓慢抽取相当于小鼠理论血量的 40（25 g 小鼠抽血 0.83 ml） 。以无创血管夹夹闭双侧颈总动脉。
10、20 min 后松开双侧血管夹，缓慢回输血液。结扎右侧颈总静脉，缝合创口。假手术组麻醉后手术分离双侧颈总动脉和右侧颈总静脉，暴露 20 min 后缝合创口。1.2.4 HO1 活性测定 I/R 30 min 后取海马。参照 Balla75方法进行，简述如下：分离海马，加 3 倍体积匀浆缓冲液（ 0.01 mol/L 蔗糖，0.01 mol/L TrisHCl， 0.000 1 mol/L EDTANa2，pH 7.4） ，4匀浆；4超声处理 30 s；18 800 r/min，4 离心 15 min；取上清 0.2 ml，加反应混合液 0.8 ml（2 mmol/L 6磷酸葡萄糖，0.2 U
11、6磷酸葡萄糖脱氢酶，20 mol/L 氯化正铁血红素，2 mg 大鼠肝胞质，0.8 mmol/L 还原型辅酶） 。酶促反应在加入还原型辅酶后开始计时，37避光反应 1 h。加预冷氯仿 1 ml 终止反应并抽提生成的胆红素。 5 000 r/min 离心 20 min，分离有机相。波长 480 nm 比色，氯仿调零（胆红素消光系数 40 mmol/cm） 。考马斯亮蓝蛋白定量。1.2.5 Western 印迹检测 HO1 蛋白表达水平 I/R 30 min 后取海马。100 mg 组织:1 ml 裂解液缓冲液（10 mmol/L TrisHCl， 0.15 mol/L NaCl，1%NP40 ，
12、1% 脱氧胆酸，0.1%SDS，1 mg/L Leupeptin，1 mg/L Pepstatin,1 mg/L Aprotonin，10%PMSF）的比例，4 冰浴匀浆，超声破碎， 12 000 r/min 离心 30 min，取上清 BCA 法蛋白定量，把样品调成相同浓度，待用。取蛋白样品（40 g 总蛋白/泳道） ，12SDSPAGE 电泳（积层胶 20 mA，分离胶 100 V）后电转移（100 V，2 h）至 PVDF 膜上。5脱脂奶粉封闭 2 h，按 1200的浓度加入一抗，37 孵育 2 h，洗 3 次，每次 5 min，11 000的浓度加入二抗，37 孵育 1 h，洗膜 5
13、次，每次 5 min，化学发6光试剂反应 2 min，发光成像仪取像并测定条带灰度值。用Quantity!One 图像分析软件进行分析。以 HO1 灰度值与actin 灰度值比值表示蛋白表达水平。比值越大，则蛋白表达越高。1.2.6 ROS、MDA、XOD 活性检测 I/R 31 min 后取大脑皮层和海马并参照试剂盒使用说明书进行测定。1.2.7 TUNEL 法原位检测细胞凋亡及图像分析 I/R 3 d 后取材，切片。参照试剂盒方法进行 TUNEL 染色，同时设立阳性对照组（加 DNase10 mg/L）和阴性对照组（不加 TdT） 。每只小鼠选取 3 张切片，在 400 倍光镜下，从海马随
14、机选取 3 个视野，将其图像扫描存入计算机，用图像分析系统测得每个视野阳性细胞的平均光密度值，3 张切片各个视野光密度值的平均值表示海马神经元的凋亡水平。1.3 统计学处理 数据用 xs 表示，采用 SPSS12.0 软件进行单因素方差分析,组间比较用 LSDt 检验。2 结 果2.1 不同预处理对海马 HO1 活性的影响 假手术组、I/R 组和7热休克 I/R 组 HO1 活性分别为（2 320.7302.7） 、 （2 981.8212.7） 、 （3 854.8293.8）pmolmg-1h-1，I/R 组、热休克 I/R 组显著高于假手术组（P0.05） ，热休克 I/R 组显著高于
15、I/R组（P0.05） 。2.2 不同预处理对海马 HO1 蛋白表达的影响 假手术组、I/R组和热休克 I/R 组 HO1 蛋白表达分别为0.110.005、0.200.011、0.310.007 ， I/R 组、热休克 I/R 组显著高于假手术组（P0.05） ，热休克 I/R 组显著高于 I/R 组（P 0.05） （图 1） 。2.3 不同预处理对 I/R 脑氧化应激功能的影响 与假手术组相比，I/R 组显著增加 MDA 和 ROS 含量及 XOD 活性(P 0.01)。热休克预处理显著抑制 I/R 引起的 MDA 和 ROS 含量及 XOD 活性增加(P 0.01)(表 1)。表 1
16、不同预处理对 I/R 脑氧化应激功能的影响(与假手术组比较：1）P0.01；与 I/R 组比较：2 ）P0.012.4 不同预处理对海马神经元凋亡的影响 假手术组、I/R 组和热休克 I/R 组细胞凋亡水平分别为0.1180.026、0.3240.024、0.2540.026，I/R 组、热休克 I/R组显著高于假手术组（P0.05） ，热休克 I/R 组显著低于 I/R 组（P 0.05） （图 2） 。8图 2 不同预处理对海马细胞凋亡影响 (TUNEL 400)3 讨 论脑血管意外致脑损伤与脑 I/R 有密切的关系已成共识8 。因此，建立尽可能近似于临床实际的脑血管意外模型是研究脑损伤机制和开发脑保护剂的基础。我们采
