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1、1炎性因子 TNF- 及 IL-18 与椎间盘退变的相关性研究作者：尚琦松，黄擘，盛文辉，曹安军【摘要 】 目的 通过测定 TNF-及 IL-18 在正常组与实验组椎间盘组织中的表达，探讨在椎间盘退变中的作用，进一步了解椎间盘退变的发生机制。方法 收集新疆石河子大学医学院第一附属医院骨科椎间盘突出症患者术后椎间盘病理组织 34 例用于实验组，年龄 2769 岁，平均年龄 46.2411.25 岁;取脊柱骨折外伤术后椎间盘组织标本 7 例，并取石河子大学医学院病理科尸检椎间盘标本 8例，共 15 例用于对照组，年龄 2552 岁，平均年龄 40.078.43岁。采用免疫组化法和 ELISA 两种
2、方法进行检测。 结果光镜下观察，免疫组化检测 TNF-、IL-18 蛋白表达阳性细胞表现为细胞浆中出现棕黄色、褐色或浅棕黄色染色，结果判定及统计学分析后表明：实验组 TNF-蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义(P0.01)，实验组 IL-18 蛋白表达高于对照组，差异有统计学意义(P0.01)。Elisa 法证实实验组中 TNF-含量为 82.1821.91 ng/ml，IL-18 的含量为 45.3921.23 ng/ml;对照组中 TNF-含量为 8.680.78 ng/ml、IL-18 含量为 3.582.84 ng/ml。两者差异均有统计学意义(P0.01)，且两种细胞因子的表达均与
3、患者年龄及病程呈正相关。结论 椎间盘组织中细胞因子 TNF-及 IL-18 表2达与椎间盘退变有关，推测可能是导致椎间盘组织退变的重要原因之一。 【关键词】 肿瘤坏死因子-; 白介素-18; 椎间盘突出症; 免疫组织化学; Elisa 法Abstract: ObjectiveTo detect the expression of tumor necrosis factor-(TNF- )and interleukin-18(IL-18)protein in herniated intervertebral disc，and discuss the role of TNF- and IL-18
4、protein in the course of the intervertebral disc degeneration and to clarify the mechanism of the lumbar intervertebral disc degeneration and herniation. MethodForty nine specimens were studied from December 2005 to April 2007 in the First Affiliated Hospital of Shihezi Medical College.Experimental
5、group contained thirty-four herniated intervertebral disc and control group contained fifteen discs，which were collected from the patients with spine fracture or autopsy. The specimens were divided into two parts，one part was fixed in 10% formalin about 24 hours and was embedded in paraffin.Four m s
6、erial sections and S-P method were used.The sections were stained with TNF- and IL-18 monoclonal antibodies，and the results 3were observed by OLYMPUS microscope.Another part was changed into well-distributed liquid，which was determined by Elisa method respectively，in order to detect density of TNF-
7、and IL-18 protein. Software SPSS 13.0 was used for statistical analysis.Result1 TNF- and IL-18 protein were expressed mostly in cytoplasma.The expression of IL-18 in the experiment group was obviously higher than in the control group.There were statistical significances(P0.01).The expression of TNF-
8、 in the experiment group was obviously higher than in the control group.There was statistical significance(P0.01).2 The method of Elisa confirmed that TNF- and IL-18 contents in the experiment group were markedly higher than the control group. There was statistical significance(P0.01).ConclusionTher
9、e is obvious link between the expression of TNF- and IL-18 proteins in herniated intervertebral disc and disc degeneration. The increase of the expression of TNF- and IL-18 proteins may be the cause of intervertebral disc herniation and disc degeneration.Key words：tumor necrosis factor-; interleukin
10、-18; intervertebral disc herniation; immunohistochemistry; enzyme 4linked immunosorbent assay人椎间盘随年龄的增长而发生退变。生理性的椎间盘退变是正常的生物学反应，但它与病理过程并无明显界限。椎间盘退变被认为是临床上椎间盘突出症、椎管狭窄、椎间盘源性疼痛、慢性下腰痛的病理基础。近年来报道由于椎间盘退变引起的腰腿痛患病率高达 65%85%，仅美国一年因此而行手术治疗的病人高达 300 000 人之多。关于椎间盘退变的机制目前仍不很清楚，许多学者认为与酶、外伤、免疫、缺氧、内分泌、生物力学、基因等因素有关1
11、。椎间盘的退变主要表现为细胞外基质的改变。目前认为生物化学机制主要是其中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-，TNF-)和白介素-18(interleukin-18，IL-18)等发挥重要作用。1 资料与方法1.1 病例收集 收集石河子大学医学院第一附属医院骨科2006 年 3 月2007 年 4 月的 41 例椎间盘疾病患者的椎间盘组织，所有组织均在手术中由同一主刀医师切取。其中 34 例腰椎间盘突出症患者术后椎间盘组织为实验组，年龄 2769 岁，平均年龄46.2411.25 岁。7 例患者脊椎骨折术后椎间盘组织和 8 例尸检正常椎间盘组织共 15 例为对照组，年龄
12、2552 岁，平均年龄40.078.43 岁。按照国际判定标准2 ，将所有组织标本经医学院5病理学专家确诊是否有退变及其程度。1.2 实验方法 每 1 例标本取出后一部分经福尔马林溶液固定24 h，石蜡包埋制成 4 m切片;另一部分研磨成组织匀浆后，离心提上清液后贴标签存放于-73冰箱备用。实验时集中取出进行免疫组化 S-P 法及 ELISA 法测定。1.3 主要试剂 羊抗人 IL-18 单克隆抗体由美国 SANTA CRUZ 公司提供，鼠抗人 TNF-单克隆抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供。1.4 结果判定标准1.4.1 免疫组化 S-P 法：TNF- 和 IL-18 的蛋白表达以在细胞
13、胞浆中出现浅棕黄色、棕黄色或褐色染色为阳性。光镜高倍视野中随机计数 10 个不重复视野，染色结果结合阳性率和着色强度进行半定量分析，由两项积分相加进行评分(见表 1)。表 1 TNF-和 IL-18 染色结果评分标准阳性细胞百分比记分着色强度强度记分评定结果积分分级 025%0 无着色 00-2650%1浅棕黄色 11-2+51 75%2 棕黄色 23-4+76100%3 棕褐色35-6+61.4.2 ELISA 法：首先在波长 450 nm 的酶标仪上读取各孔各组织匀浆样品的 OD 值;然后将读取的 OD 值及标准品浓度值输入ELISA Calc.exe，可得出标准曲线图 ;最后将样品的 O
14、D 值依次输入，可得出各组织匀浆样品的浓度值。1.5 统计学处理采用 SPSS 13.0 统计软件对数据进行分析，其中免疫组化检测 TNF-和 IL-18 蛋白表达以阳性率表示，采用秩和检验;ELISA 法检测 TNF-和 IL-18 蛋白表达的数据以均数 标准差(xs)表示，采用 t 检验;TNF- 和 IL-18 表达与年龄、病程的相关性采用Spearman 及 Pearson 相关分析。P0.05 认为差异有统计学意义。2 结果2.1 HE 观察结果：退变椎间盘组织细胞密度较大多数组织的细胞密度低，细胞分布不均匀，结构不清晰，胶原纤维排列紊乱，退变的髓核组织细胞胞质空泡化，出现肥大的软骨
15、细胞“巨克隆” ，呈现出软骨细胞的巢样结构，脊索细胞和软骨细胞分布在髓核与纤维环中，髓核组织内的基质降解明显，正中有空隙出现(见图 12) 。72.2 免疫组化 S-P 法检测结果：TNF- 、IL-18 的蛋白表达着色于细胞胞浆，呈浅棕黄色、棕黄色或褐色染色颗粒(见图 34);且 TNF-、IL-18 在退变组椎间盘组织中的阳性表达明显高于对照组，两组差异有统计学意义(P0.01)(见表 2)。表 2 TNF-和 IL-18 在正常与退变椎间盘组织中的表达比较 TNF-IL-18-+阳性率(%)-+阳性率(%) 正常组 1140026.67141006.67 退变组 21291194.125
16、913785.29 注：经秩和检验，TNF- 的 u 值为22.757，P=0.000;细胞因子 IL-18 的 u 值为 18.929，P=0.0002.3 ELISA 法检测结果示： 实验组 TNF-、IL-18 含量分别为82.1821.91 ng/ml、45.3921.23 ng/ml，均明显高于对照组8.680.78 ng/ml、3.582.84 ng/ml，差异有统计学意义 (见表 3)。2.4 再经相关性分析得知：退变组椎间盘组织中 TNF-的含量与患者年龄呈正相关(r=0.778，P0.01)，与患者病程呈正相关(r=0.732 ，P0.01);组织中 IL-18 的含量与患者年龄呈正相关(r=0.806， P0.01)，与患者病程呈正相关(r=0.855，P0.01)。3 讨论
