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1、1灵芝活性多糖的提取工艺研究【摘要】 目的 确立水提醇沉法与超声提取法相结合提取灵芝活性多糖的最佳工艺。方法 以脾细胞代谢 MTT 活力为评价指标，采用正交试验对超声时间、水提温度和水提时间等因素进行考察，寻求最佳的提取工艺。结果 各因素对灵芝多糖脾细胞代谢 MTT 活力的影响大小排列为: 超声时间 水提温度水提时间,超声时间对灵芝多糖活性影响显著。提取最佳工艺为：超声提取时间 20 min，水提取温度 80 ，水提取时间 2 h。结论 本工艺为提取活性灵芝多糖提供了一定的参考。 【关键词】 灵芝多糖;脾细胞;提取工艺;正交试验Abstract:Objective To explore an
2、optimum extraction procedure(water extractionalcohol precipitation and ultrasonic extraction method) of active polysaccharides from Ganoderma lucidum.Methods By using colorimetric methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay of splenic cells of mice as evaluation indicator,orthogonal test was conducted
3、to evaluate ultrasonic extraction time,water extraction temperature,and water extraction time to explore the optimal extraction procedure.Results The main influencing factors of 2colorimetric methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay of splenic cells of mice were ultrasonic extraction time，water extr
4、action temperature，and water extraction time in turn. The optimal conditions of orthogonal experiment：ultrasonic extraction for 20 minutes,water extraction at 80 for 2 hours. Ultrasonic extraction time had significant effect on extraction of active polysaccharides from Ganoderma lucidum.Conclusion T
5、he technology provided references for extraction of active polysaccharides from Ganoderma lucidum.Key words:Ganoderma lucidum polysaccharides;splenic cells;extraction procedure;orthogonal experiments灵芝是我国传统的补益中药，现代研究表明灵芝多糖是其主要活性成分之一，灵芝多糖具有抗肿瘤及免疫调节作用1，2 。灵芝多糖提取方法有传统的水提醇沉法3，4、超声波法4-6、酶法，还有冷冻预处理法、超声波催化
6、纤维素酶法、超临界萃取法等。灵芝多糖的活性在不同的提取工艺中变化很大，提取率高并不意味其有效活性高。现有文献对灵芝多糖提取工艺的研究未与其活性联系起来。本文拟采用水提醇沉法和超声波法相结合提取灵芝活性多糖，应用正交试验法设计试验，探讨提取工艺中影响因素对多糖活性的影响，采用小鼠脾细胞增殖实验检测多糖的免疫活性，确立优化的3提取工艺。1 实验材料1.1 动物SPF 级近交系 BALB/c 小鼠，雌雄兼用， 810 周龄，体质量(202)g，由南方医科大学实验动物中心提供，证号：SCXK(粤)20060015。1.2 材料灵芝( 产地：广西，批号：20080101，广州市药材公司中药饮片厂)。1.
7、3 仪器LIBROR AEG220G 型电子天平(SHIMADZU Corporation);超声仪(广州华南超声设备厂);恒温水浴器(汕头市医用设备厂有限公司);RE52A 型旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司 );D12SA型鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司);DOAP133AB8型抽滤减压泵(Gast Manufacturing,Inc.);ST21 型高速冷冻离心机4(美国杜邦公司);Universal 16A 型低速离心机(Hettich 公司);Benchmark PlusTM 型连续波长酶标仪(BioRAD 公司);5410 型CO2 培养箱(Thermo 公司)。
8、1.4 试剂95%乙醇( 广东广宁县葡萄糖药业有限公司，批号：20071101);葡萄糖、硫酸等试剂均为分析纯;重蒸苯酚(南方医科大学化学教研室);RPMI 1640 培养基(GIBCO 公司产品);噻唑兰(MTT)、Con A(刀豆蛋白 A)均为 Sigma 公司产品。2 方法2.1 正交试验设计根据文献报道，超声提取时间(因素 A)、水提取温度(因素 B)、水提取时间(因素 C)对灵芝多糖的提取影响较大，最佳的提取条件在一定范围之内，超声时间为 2040 min，提取时间为 1.53 h，提取温度为 80100 6-8。根据预实验及文献，本文正交试验对上述三因素，每个因素设三水平进行考察，
9、以脾细胞代谢 MTT 活力作为考察指标。根据正交试验的综合评分选择最佳方案。正交设计选用 L9(34)正交表，见表 1。52.2 提取方法精密称取灵芝粉 50 g 置圆底烧瓶中，加入 10 倍量乙醇， 70 水浴回流 30 min 作预处理，过滤，滤渣置圆底烧瓶中，加入15 倍量水后按照正交水平表进行试验，先进行超声(因素 A)处理，超声完成后，放入恒温水浴器内，按照提取温度(因素 B)和时间( 因素 C)条件的三水平平行操作，水提完成后过滤，滤液于 210 冷藏放置过夜，抽滤，滤液减压浓缩至约 100 mL，加入 3 倍量乙醇，210 冷藏放置过夜，抽滤，沉淀用 100 mL 热水溶解，水浴
10、蒸至稍干后 60 恒温干燥，得水溶性粗多糖，精密称量后计算多糖提取率和含量。表 1 正交试验的因素水平表2.3 多糖的测定灵芝多糖的测定采用苯酚 硫酸比色法，以葡萄糖为标准品。2.4 脾细胞代谢 MTT 活力测定取健康 BALB/c 小鼠，脱颈椎处死，无菌取出脾脏，常规制备脾细胞悬液,用含 10%新生牛血清 RPMI 1640 培养液( 以下简称6全培)调整细胞浓度为 8106 个/mL ,在已加好待测样品或者对照试剂的 96 孔板中每孔加入上述细胞悬液 100 L。使总体积为 200 L，置培养箱中在饱和湿度、5%CO2、37 条件下培养 48 h。小鼠脾细胞培养结束前 4 h，每孔加入 0
11、.25%MTT(生理盐水配制)20 L，继续培养 4 h，然后每孔加二甲基亚砜 100 L，振摇2 min 使 MTT 的紫色还原产物完全溶解。最后用酶标仪在 570 nm 处测定光密度，结果用 570 nm 处的吸光度值(A)表示。2.5 统计分析采用 SPSS 13.0 统计软件中的正交设计方差分析法对数据进行统计分析。3 结 果正交试验结果见表 23。从表 2 中脾细胞代谢 MTT 活力极差(R) 可知，影响因素主次顺序为 A BC，各因素的最佳水平分别为 A123，B123，C213;从表 3 方差分析结果可见，除 A 因素对脾细胞代谢 MTT 活力有显著性影响外，其他因素均无显著性影
12、响。综合以上结果，确定最佳提取工艺为 A1B1C2，即超声提取时间 20 min，水提取温度 80 ，水提取时间 2 h。表 2 正交试验结果表 3 方差分析(依据多糖脾细7胞代谢 MTT 活力)4 讨 论4.1 本文采用水提醇沉法 超声提取法作为灵芝活性多糖的提取工艺，两种方法结合显著减少水提时间和次数，减少对多糖活性的破坏，多糖含量比文献报道3，4 ，6，9的结果有显著提高。4.2 超声 20 min 的脾细胞代谢 MTT 活力比 30 min 和 40 min 的高。原因是超声波具有较强的机械剪切作用，长时间作用使多糖结构破坏，导致多糖活性下降。另外，超声时间过长，细胞进一步破碎，杂质溶
13、出去杂质时造成多糖损失，这也是多糖提取率有所下降的原因之一。4.3 水提时间 2 h 的脾细胞代谢 MTT 活力比 1 h 和 3 h 的高;水提温度 80 的脾细胞代谢 MTT 活力比 90 和 100 的高。原因是提取时间增加，促进细胞的多糖物质向外扩散，但随着时间和温度进一步增加，细胞破碎程度过大，长时间热水提取，多糖分子容易受热分解，使多糖活性有所下降。4.4 有文献报道有关灵芝多糖有水不溶性多糖、水溶性多糖、酸性多糖、碱性多糖等10 ，11 。本文的提取工艺可能使一部分多8糖，如水不溶性多糖，在乙醇的预处理和热水提取后加入乙醇沉淀的过程中被弃去，得到的主要是水溶性多糖，因此这可能是本
14、文实验中的灵芝多糖提取率比文献报道8，10要低的原因之一。【参考文献】1 戴则林，董昌武. 灵芝多糖的生物活性研究进展J. 安徽中医学院学报，2005，24(5):60-62.2 宁安红，曹婧，黄敏等. 灵芝多糖对荷瘤小鼠肿瘤免疫系统的影响J.中国微生态学杂志， 2004，16(1):16-17.3 李艳，赵海燕，率建宁.灵芝多糖提取工艺研究 J.中成药，2006，28 (7):1052-1054.4 胡斌杰，陈金锋，王宫南. 超声波法与传统热水法提取灵芝多糖的比较研究J.食品工业科技，2007 ，28(2):190-192.5 郭孝武. 超声技术在中草药成分提取中的应用J.中草药，1993，
15、24(10):548.6 徐凌川，张华，许昌盛，等. 超声波提取灵芝多糖的最佳工艺探讨J.中国中药杂志， 2005，30(6):471-472.97 刘英梅，李春华，陈鸿雁. 灵芝孢子粉中多糖提取工艺的研究J.中成药，2006，28(3):332-335.8 罗立新，姚汝华，周少奇.灵芝多糖的分离与纯化J.食品工业科技，1998，3(3):4-7.9 胡斌杰，韩艳霞，姬红. 正交试验法超声提取灵芝多糖的最佳工艺研究J.中药材， 2008，31(1):142-143.10 鉏晓艳，张日俊，张功，等. 灵芝多糖的结构及功能研究J.饲料研究，2004，12:37-39.11 张卫国，刘欣，陈永泉.灵芝多糖的研究进展J.饮料工业，2003，6(4):5-10.
