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1、 你的首选资源互助社区微生物的培养和应用一、考点解读1、考点盘点内容 说明（1）微生物的实验室培养（2）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数来源:Z_xx_k.Com（3）分解纤维素的微生物的分离贴近生活且注意和必须一酶的有关知识相联 系2、考点解读本专题主要考点有微生物的分离和培养、微生物数量的测定、选择培养基的利用、利用微生物发酵来生产人类需要的的产物以及微生物的其他方面的引用。微生物的培养、培养基对微生物的选择利用、利用微生物发酵来生产特定的产物是高考热门。近年来不少地方的试题都多有涉及。微生物的培养和应用是选修一选修部分的重点，高考的时候也经常考到。从命题角度看主要是以微生物的应用为考察
2、对象，进行实验设计或者其他考察，考察的内容多种多样。二、知识网络三、本单元分课时复习方案一微生物的实验室培养（一）培养基（1）培养基可分为液体培养基和固体培养基（按照物理性质） 。在液体培养基中加入凝固土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分解尿素菌的分离与计数实验设计1、土壤取样2、普通培养基与选择培养基的制备原理3、培养与计数3、不同种类加酶洗衣粉的洗涤效果比较微生物的实验室培养培养基制备无菌操作技术1、目的要明确2、营养要协调3、pH 要适宜1、灭菌与消毒2、方法和原理分解纤维素的微生物的分离分解纤维素菌的分离实验设计1、分离原理1、土壤取样2、分离培养、鉴定基础过关 你的首选资源互助社区剂
3、琼脂后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。（2）各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种营养物质。满足微生物生长还需要适宜的 pH、氧气的要求（根据微生物的需求提供有氧或无氧环境） 、特殊营养物质等。碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如 CO2、Na HCO3 等无机碳源；糖类、蛋白质、脂肪等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。来源:学科网 ZXXK氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如 N2、NH 3、NO 3-、NH 4+、蛋白质、氨基酸等。只有固氮微生物才能利用 N2。（二）无菌
4、技术（1）获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接 触。（2）消毒与灭菌的区别消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子） 。消毒方法常用煮沸消毒法，还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、红外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热
5、灭菌、高压蒸汽灭菌。（三）制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2）倒平板操作的步骤：将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约 1020mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。等待平板冷却凝固，大约需 510min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。（四）纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。（
6、3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而 能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。 你的首选资源互助社区将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿
7、。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。将平板倒置放入培养箱中培养。（6）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810s。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。（五）菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。临时保藏方法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入 4的冰箱中保藏。以后每 36 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培
8、养基上。缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中，装入 1mL 甘油后灭菌。将 1mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在20的冷冻箱中保存。（六）实验安排及注意事项（一）从菌种保藏中心购买菌种后，教师首先需要用平板划线法纯化培养所得菌种，并根据学生小组的数目，准备好数个平板。（二）第 1 课时完成基础知识的教学，学习各种操作方法，并制备培养基。高压蒸汽灭菌所需要的时间较长，因此需要利用课下时间完成。课下完成后，再于第 2 课时完成大肠杆菌的纯化培养。 此后安排学生连续观察记录 34d。（
9、三）配制培养基时，教师需要提示学生按照每个培养基消耗 1520m L 的量来估算总用量。全班同学的培养基可以集中起来，分批灭菌。（四）灭菌后，培养基冷却到 55后应及时进行倒平板操作。如果不能及时操作，需要将培养基放到 55左右的电热箱中保温，以防止琼脂凝固。（五）如果打算做本专题的第 2 或第 3 课题，建议此课题不仅要练习平板划线操作，还要练习稀释涂布平板法操作。为此，教师需要提前 1 天用液体培养基培养大肠杆菌，培养一夜后，于第 2 天将培养液分发到各小组。（六）实验后，所有用过的培养基、培养液等都需要统一进行高压蒸汽灭菌后再丢弃，否则将会造成环境污染。二土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
10、（一）筛选菌株（1）实验室中微生物的筛选应用的原理人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH 等） ，同时抑制或阻止其他微生物生长。（2）选择性培养基在微生物学中，将 允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 你的首选资源互助社区（3）配制选择培养基的依据根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。（二）统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数
11、。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置 35 个平板，选择菌落数在 30300 的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。（三）设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（四）实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。（1）土壤取样从富含有机物、
12、潮湿、pH 7 的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约 38cm 的土壤层取样。（2）制备培养基准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。（3）微生物的培养与观察将土样以 1、101、102依次等比稀释至 107 稀释度，按照浓度从低到 高的顺序涂布平板，不必更换移液管。注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。将涂布好的培养皿放在 30温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。（4）细菌的计数当菌落数目稳定时，进行计数，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落
13、的数目。求出平均值，根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。（五）实验案例土壤中某样品细菌的分离与计数。实验的具体操作步骤如下。1土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土 3cm 左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。2制备培养基准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为 103107。每个稀释度下需要 3 个选择培养基，1 个牛肉膏蛋白胨培养基
14、，因此共需要 15 个选择培养基，5 个牛肉膏蛋白胨培养基。此外， 你的首选资源互助社区还需要准备 8 个灭菌的试管和 1 个灭菌的移液管。3微生物的培养与观察参考课本中图 2-7 的实验流程示意图，将 10g 土样加入盛有 90mL 无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为 250mL） ，充分摇匀，吸取上清液 1mL，转移至盛有 9mL 的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至 107 稀释度，并按照由 107103 稀释度的顺序分别吸取01mL 进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。将涂布好的培养皿放在 30温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比
15、较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图 2-10 的颜色反应。4细菌的计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在 30300 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3 个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。三、分解纤维素的微生物的分离（一）纤维素与纤维素酶（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即 C1 酶、CX 酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。（二）纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤
