水通道蛋白0，1在STZ-糖性白内障发病机制中的研究

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1、1水通道蛋白 0，1 在 STZ-糖性白内障发病机制中的研究作者：林雯， 谢茂松， 徐国兴， 何青， 郑卫东【摘要 】 目的 研究水通道蛋白 0，1(AQP0、AQP1)在链脲佐菌素(STZ)-糖尿病性白内障发病机制中的作用。 方法 将 40 只 SD 大鼠随机分为对照组与糖尿病性白内障组 2 组，用 STZ 腹腔注射诱发糖尿病性白内障，每周观察晶状体的变化。分别于实验开始后2，8 周末摘取眼球，采用免疫组织化学染色技术检测 AQP0 及AQP1 在晶状体中的表达，各检测 10 只大鼠 20 眼。 结果 对照组晶状体保持透明，糖尿病性白内障晶状体在 2 周末出现空泡，8 周末完全混浊。AQP0

2、 及 AQP1 在对照组中阳性表达，糖尿病性白内障组 2 周表达较对照组强，组间差别具有统计学意义(AQP0：t2 周末=3.598，P=0.001;AQP1：t2 周末=3.103，P=0.004);糖尿病性白内障组 8 周表达较对照组弱，组间差别具有统计学意义(AQP0：t8 周末=6.994，P0.001;AQP1：t8 周末=4.475，P0.001)。 结论 AQP0 及 AQP1 表达异常与糖尿病性白内障的发生、发展有关。 【关键词】 水孔蛋白类;链脲菌素;免疫组织化学;白内障;糖尿病并发症2糖尿病性白内障是严重的致盲性眼病，进展较快，常常双眼同时发病。水通道蛋白(aquapori

3、n, AQP)在眼部广泛分布，有效的水转运对维持眼的正常功能是必需的。晶状体细胞表达的 AQP 维持晶状体的脱水状态、透明性。本实验通过免疫组织化学技术检测 AQP0及 AQP1 在糖尿病性白内障的表达及分布，探讨其在链脲佐菌素(STZ)-糖尿病性白内障发病机制中的作用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动物 SD 大鼠 40 只，雌雄不限，体质量 (1505)g，购自福建医科大学实验动物中心动物合格证号：SCXKC( 闽)2004 0009。随机分为 2 组：对照组与糖尿病性白内障组。1.1.2 主要试剂与仪器 STZ(美国 Sigma 公司); 兔抗鼠AQP0，兔抗鼠 AQP1 单克隆

4、抗体(美国 Santa Cruz 公司)，SP 试剂盒(北京中杉公司 )。 Olympus 显微镜(BH-2 型，日本 Olympus公司); 微量快速血糖仪器(ONE TOUCH II 型，美国强生医疗器材公司);HPLAS1000 高清晰彩色图像细胞测量系统( 武汉同济千屏影像公司)。31.2 方法1.2.1 制作动物模型 大鼠禁食 12 h，对照组一次性腹腔注射柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 4.5);糖尿病性白内障组一次性腹腔注射 2%STZ 溶液( 临用时以 0.1 mol/L、pH 4.5 的柠檬酸缓冲液配置)，剂量为 70 mg/kg。3 d 后于大鼠尾静脉采血测血糖浓度

5、，排除血糖16.7 mmol/L 的大鼠。1.2.2 观测指标及方法 注射后，每周裂隙灯下观察晶状体变化 1 次，每 2 周监测血糖 1 次。在实验开始后 2 周末及 8 周末，对照组和糖尿病性白内障组各取动物 10 只(20 只眼)，常规摘取眼球。将取出的眼球立即分别用 10%中性福尔马林液固定，石腊包埋切片(0.3 m)，行免疫组织化学 SP 二步法检测晶状体中 AQP0 及AQP1 的表达，以 PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照。1.2.3 结果判断 AQP0 及 AQP1 抗原以细胞膜和细胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。采用 HPLAS-2000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统对 AQ

6、P0 及 AQP1 的表达进行定量分析，每个标本随机选取 5 个完整而不重叠的高倍镜视野 (400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度，以 5 个视野的平均光密度的平均值作为测量值。41.3 统计学处理 数据以 xs 表示，采用 SPSS 12.0 软件包进行统计处理，组间比较采用成组 t 检验，以 P0.05 表示差别有统计学意义。2 结 果2.1 裂隙灯观察 实验过程中对照组大鼠晶状体全部透明 ;糖尿病性白内障组约于第 2 周末在晶状体周边部见到空泡，第 4 周末见到絮状混浊，第 8 周末完全混浊。2.2 AQP0 及 AQP1 在晶状体中的表达 对照组晶状体纤维可见 AQP0 棕黄色阳

7、性表达;糖尿病性白内障组 2 周中晶状体纤维AQP0 表达较对照组强;糖尿病性白内障组 8 周中晶状体纤维 AQP0表达较对照组弱，组间差别均有统计学意义(AQP0：t2 周末=3.598，P=0.001;t8 周末=6.994，P0.001;图 12)。晶状体上皮细胞中可见到 AQP1 棕黄色阳性表达;糖尿病性白内障组 2 周中晶状体上皮细胞 AQP1 表达较对照组强;糖尿病性白内障组 8 周中晶状体上皮细胞 AQP1 表达较对照组弱，组间差别均有统计学意义(AQP1：t2 周末=3.103，P=0.004;t8 周末=4.475，P0.001;图 12)。5免疫组织化学 SP 法，DAB

8、染色，苏木素复染， 400. A、A1 ：阴性对照;B、 B1：对照组;C、C1：糖尿病性白内障组 2 周;D、D1 ：糖尿病性白内障组 8 周. AD 为 AQP0;A1D1 为 AQP1.3 讨 论研究发现正常晶状体纤维可见 AQP0 表达，晶状体上皮细胞中可见到 AQP1 表达。AQP 是一族介导水沿渗透压梯度被动跨生物膜转运的跨膜蛋白质，对水有高度选择性，参与晶状体的水代谢，维持晶状体的生理动态平衡和晶状体的透明性起到了重要的作用1。糖尿病性白内障组早期晶状体纤维 AQP0 表达增强，晶状体上皮细胞 AQP1 表达明显增强。糖尿病性白内障由于血糖增高，血糖通过房水迅速扩散到晶状体内，使

9、己糖激酶活性达饱和，并激活醛糖还原酶，过多的葡萄糖通过山梨醇通路转化为山梨醇和果糖，这类糖醇一旦在晶状体内产生，便不易通过囊膜渗出，从而造成山梨醇在晶状体内积聚，增加了晶状体的渗透压。高渗可刺激晶状体代偿性增加 AQP，以增加对水的通透性，这是机体代偿能力的表现。AQP1 具有非常强的双向通透水分子的能力，为开放构象，其通透性可以达到脂质双分子层的 10100 倍2。AQP0 是晶状体纤维细胞膜上最多见的内在性蛋白，其空间结构形似陈列的金属杯，具有水通道蛋白家族共同的分子结构特点。与其他水孔为开放构象的水6通道不同的是：AQP0 是活体内已知的唯一形成膜节点的水通道，且节点上的 AQP0 水孔

10、是闭合的3。AQP0 这一特殊结构可能提示AQP0 水通透作用的可调节性可能强于其他水通道。AQP1 运输水需要的活化能大约为 10.46 KJ/Mol，AQP0 运输水需要的活化能大约为 29.29 KJ/Mol，比 AQP1 所需的活化能高4。AQP0 属于只对水有渗透性，对其他小分子溶质无渗透性的选择性水通道。这保证了晶状体纤维的细胞内环境稳定。高渗刺激晶状体代偿性增加AQP，使大量水分通过 AQP1 进入晶状体内以维持渗透压平衡，白内障的晶状体纤维肿胀，排列紊乱。由于 AQP0 对水分的通透性远不及 AQP1 强，且糖尿病时 AQP0 的糖基化使 AQP0 的构象发生改变， 与对照组比

11、较，：P0.05;：P0.01.与钙调节蛋白结合能力下降5。因此，水分在晶状体内分布不均匀从而形成囊泡，水隙和板层分离。如果血糖降低，积聚的山梨醇和果糖缓慢地通过晶状体囊膜排出，晶状体内渗透压下降，晶状体内的水分随渗透压梯度排出，膨胀的晶状体随之缩小，近视度数降低。糖尿病性白内障组晚期中晶状体纤维 AQP0 表达减弱，晶状体上皮细胞 AQP1 表达明显减弱。糖尿病时，晶状体囊膜的正常生理功能遭到破坏，能量代谢障碍，细胞内合成功能下降，AQP0 及AQP1 表达下降，导致晶状体纤维水分运转失代偿。此外，AQP07四周由连接子(Connexons，Cx)相连而有序地排列于晶状体纤维细胞上，这是 A

12、QP0 可调节性水通透作用所必须的6 。糖尿病还可引起晶状体纤维细胞的 Cx 退化，导致晶状体纤维细胞上 AQP0 排列紊乱，引起晶状体纤维水分运转障碍7。晶状体纤维水分运转失代偿引起晶状体循环障碍、代谢废物蓄积，晶状体纤维细胞排列紊乱，透明性难以维持，出现不溶性蛋白的凝聚体，晶状体纤维变性，形成白内障8。本研究发现糖尿病性白内障晶状体上 AQP0 及 AQP1 的表达呈双相变化，早期表达增高，这是机体代偿机制的表现;晚期表达下降，这是细胞失代偿，细胞老化的表现。这促使人们从分子水平认识 AQP0 及 AQP1 在糖尿病性白内障水代谢障碍中的病理生理机制，为寻找更为有效的防治方法提供新的理论依

13、据。【参考文献】1 Venkman A S. Role of aquaporin water channels in eye functionJ. Exp Eye Res, 2003,76(2):137-143.2 Park J H,Saier M H Jr. Phylogenetic, structural and functional characteristics of the Na-K-Cl cotransporter familyJ. J Membr Biol, 1996,149(3):161-168.83 Varadaraj K,Kumari S S,Patil R, et al.

14、 Functional characterization of a human aquaporin 0 mutation that leads to a congenital dominant lens cataractJ. Exp Eye Res, 2008,87(1):9-21.4 Chandy G,Zampighi G A,Kreman M, et al. Comparison of the water transporting properties of MIP and AQP1J. J Membr Biol, 1997,159(1):29-39.5 Swamy-Mruthinti S

15、. Glycation decreases calmodulin binding to lens transmembrane protein, MIPJ. Biochim Biophys Acta, 2001,1536(1):64-72.6 Buzhynskyy N,Girmens J F,Faigle W, et al. Human cataract lens membrane at subnanometer resolutionJ. J Mol Biol, 2007,374(1):162-169.7 Mangenot S,Buzhynskyy N,Girmens J F, et al. M

16、alformation of junctional microdomains in cataract lens membranes from a type II diabetes patientJ. Pflugers Arch, 2009,457(6):1265-1274.98 Hegde K R,Henein M G,Varma S D. Establishment of mouse as an animal model for study of diabetic cataracts: biochemical studiesJ. Diabetes Obes Metab, 2003,5(2):113-119.