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1、1散发性大肠癌 hMLH1 和 APEX 基因多个单核苷酸多态性的检测及意义作者：李静 陈丽 肖琳 安鼎伟 李迎杰【摘要 】 目的 探讨 hMLH1 T1151A 和 APEX A1247G， APEX T2197G 多个单核苷酸多态性与散发性大肠癌的关系。方法 选取散发性大肠癌患者 100 例，并以 100 例正常人为对照。基因组 DNA 分别由大肠癌患者的癌组织中及健康人的外周血白细胞中提取，采用单链构象多态性分析结合基因序列分析，检测hMLH1 T1151A 和 APEX A1247G、APEX T2197G 的多态性。结果 hMLH1 T1151A 的多态性在正常人中发生率 1.0%，
2、在散发性大肠癌组中发生率 11.0%，差异有显著性(24.48，P0.05)；APEX A1247G 的多态性在正常人中发生率 1.0%，在散发性大肠癌组中发生率 13.0%，差异有显著性(24.84，P0.05)；APEX T2197G 的多态性在正常人中发生率 3.0%，在散发性大肠癌组中发生率 27.0%，差异有显著性(29.44，P0.01)。关联性分析显示 hMLH1 T1151A 和 APEXA1247G 无相关性，和 APEXT2197G存在相关性；APEXA1247G 和 APEXT2197G 存在相关性。结论 hMLH1 T1151A 和 APEX A1247G、APEX T
3、2197G 的多个单核苷酸多态性可能与散发性大肠癌的发生有关，可作为散发性大肠癌的筛查和预后监测指标。 2【关键词】 大肠癌；单核苷酸多态性；APEX；hMLH1大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，也是众多肿瘤中遗传因素最突出的一种肿瘤。研究表明，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP ） ，尤其是位于蛋白编码区的SNP 和位于表达调控序列的 SNP 在功能和致病方面具有重要意义1 。DNA 修复能力的个体差异可能是决定肿瘤遗传易感性的极为重要的因素，一些 DNA 修复基因所具有的 SNP 可能导致氨基酸的改变从而影响其 DNA 修复活性2 。hMLH1
4、 基因是错配修复基因，是细胞内修复系统的重要组成基因，它的突变导致基因功能的丧失是遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)发病的主要原因之一3 。脱嘌呤/ 嘧啶核酸内切酶(APEX)是碱基切除修复过程中的限速酶，参与DNA 损伤修复，与氧化还原有关，与凋亡相关4 。本实验应用单链构向多态性分析（single strand conformation polymorphism，SSCP）及 DNA 测序法，对辽西地区散发性大肠癌患者 hMLH1 和 APEX 基因的多个 SNP 进行联合检测，以探讨hMLH1 和 APEX 基因的多个 SNP 与大肠癌之间的关联，为大肠癌的筛查和预后监测提供指标。1 材
5、料与方法31.1 病例资料 大肠癌患者均为 2006 年 1 月至 2008 年 12 月辽宁医学院附属第一医院普外科住院病例，男 45 例，女 55 例，年龄 2278 岁，平均年龄（56.4210.35）岁，家族中无大肠癌病人。术前均未经放化疗，术后病理证实为大肠癌。每个病例均取新鲜癌组织，-80保存，提取 DNA 待用。同时取 100 名健康志愿者的静脉血 5 ml，提取 DNA 作对照。1.2 方法1.2.1 实验试剂DNA 提取试剂盒，DNA 回收纯化试剂盒，Taq 聚合酶等均购自上海 Gentime 公司，常规试剂由本院实验中心提供。引物由上海生工公司合成，DNA 测序由大连宝生物
6、公司完成。1.2.2 基因组 DNA 提取采用 DNA 提取试剂盒提取癌组织和静脉血的基因组 DNA。严格按说明书操作。DNA 提取后用紫外分光光度计检测 DNA 含量，A260/A280 为 1.652.0。DNA 置-20冰箱保存。41.2.3 PCR 引物设计及反应条件根据参考文献2设计 3 对引物,引物序列及扩增长度见表1。PCR 反应体系 25 l，Mix 12.5 l，双蒸水 8.5 l，引物各 1 l，模板 2 l。反应条件：hMLH1 ：94预变性 5 min；94 40 s，55 40 s，72 1 min；72 10 min;APEX：94 预变性 5 min；94 30
7、s，58 30 s，72 1 min；72 10 min。表 1 PCR 扩增引物序列及扩增长度（略）1.2.4 SSCP取 5 l PCR 产物加 5 l变性缓冲液，95 变性 10 min，后置于冰上 10 min，将此混合物全部上样，行 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳条件：电泳缓冲液 1TBE，电压 120 V，电泳 8 h。电泳结束后凝胶用 0.2%硝酸银染色并干燥保存。有异常泳动条带者为阳性病例。1.2.5 DNA 测序将 SSCP 测定有异常泳动条带病例的肿瘤组织和正常组织PCR 产物进行直接 DNA 测序。51.3 统计学方法应用 SPSS12.0 软件行相关数据分析，采用 RC
8、 表 2检验及四格表 2检测。APEX、hMLH1 的相关性比较采用 22 配对资料的关联性分析。2 结 果2.1 hMLH1 的 SNP 的检测大肠癌组中 11 例 hMLH1 的 1151 位碱基发生杂合型突变TA，基因频率 hMLH1 T1151A (11/200） ，其中杂合子 TA10 例，纯合子 AA1 例。正常对照组中 1 例 hMLH1 的 1151 位碱基发生杂合型突变 TA，基因频率 hMLH1 T1151A（1/200） 。两组相比差异有显著性 (24.48，P0.05) 。2.2 APEX 的 SNP 的检测大肠癌组中 13 例 APEX 的 1247 位点存在 A G
9、 的多态性，基因频率 APEX A1247G（13/200 ） ，12 例为杂合子(AG);1 例为纯合子(GG)； 100 例正常对照组中 2 例 APEX 的 1247 位碱基发生杂6合型突变 TA，基因频率 APEX A1247G（2/200） ，两组相比，差异有显著性(2 4.84，P0.05) 。100 大肠癌组中 27 例 APEX的 2197 位点存在 TG 的多态性，纯合子 GG 3 例，杂合子 GT 24例，基因频率 APEX T2197G（27/200 ） ；100 例正常对照组中 3例 APEX 的 2197 位碱基发生杂合型突变 TG，基因频率 APEX T2197G（
10、3/200） ，两组相比差异有显著性(29.44，P0.05)。2.3 大肠癌组 hMLH1 和 APEX 的 SNP 的相关性分析大肠癌组 hMLH1 T1151A 和 APEX A1247G 经 22 配对资料的关联性分析，2=0.05，P=0.824，提示无相关性；大肠癌组hMLH1 T1151A 和 APEX T2197G 经 22 配对资料的关联性分析，2=6.25，P=0.011 ，列联系数 r=0.243，提示存在相关性；大肠癌组 APEX A1247G 和 APEX T2197G 经 22 配对资料的关联性分析,2=4.971，P=0.024，列联系数 r=0.218，提示存在
11、相关性。3 讨 论SNP 是指基因组 DNA 中某一特定核苷酸位置上发生置换、颠换、缺失和插入等变化，而且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。通常认为 SNP 只有两种类型，即双等位基因。基因组中的SNP 有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病,特别是对7复杂疾病的易感性。因此,寻找不同疾病相关的 SNP 对疾病的预测、诊断和治疗意义重大。散发性大肠癌的发病率高，发病原因复杂，虽然无明显家族史，但其分子生物学特征、临床病理表现及预后与遗传性非息肉性大肠癌有许多相似之处。错配修复（mismatch repair，MMR）基因是纠正碱基错配的主要因子，目前已发现人类的 MMR 系统含
12、有 9 个错配修复基因，其中以 hMLH1 和 hMSH2 功能最为重要。hMLH1 和 hMSH2 的突变是造成某些散发性结肠癌发生的主要原因。不过在散发性结肠肿瘤 hMLH1 表达缺失率高于 hMSH2。hMLH1 基因定位于3p21，cDNA 全长 2 484 bp，编码由 756 个氨基酸残基组成的蛋白。近年研究已发现在大肠癌患者中存在 hMLH1 基因的多个 SNP位点。有报道部分 HNPCC 患者中 hMLH1 基因在第 4l 位密码子有一个 CT突变，使相应的氨基酸残基由丝氨酸变成苯丙氨酸，还有人检测到第 578 至 632 位密码子之间的杂合性缺失及从第 727 位密码子的第一
13、个核苷酸开始的 4 个核苷酸的缺失，在另外一些病例的第 519 位密码子则存在一个 T 的插入，造成 hMLH1 蛋白产物的羧基端 238 个氨基酸残基的缺失5 。Song 等6报道在 115例结直肠癌患者中 hMLH1 A655G 占 11.3%，在正常对照人群中的发生率仅 3.0% ，提示 hMLH1 A655G 可能在结直肠癌的癌变8中发挥重要作用。国内范凯等7 研究显示 50 例结肠癌标本有 3例 hMLH1 基因第 12 号外显子检出突变，突变位点均是第 1151 位碱基发生杂合型突变 TA，认为散发性大肠癌 hMLH1 基因第 384位密码子的错义突变可能增加罹患大肠癌的危险性。但
14、该研究缺乏正常人群对照。张晓梅等8 在结直肠癌患者的体细胞中发现了位于 hMLH1 基因第 ll5l 位碱基 TA的杂合型颠换，导致其第 384 位编码氨基酸由缬氨酸(Va1)突变为天冬氨酸(Asp)。 本研究结果显示散发性大肠癌 hMLH1 基因的 1151 位碱基发生杂合型突变 TA，基因频率 hMLH1 T1151A（11/200 ） ，与正常对照组基因频率hMLH1 T1151A（1/200 ）相比差异有显著性。此与上述结果基本一致，提示 hMLH1 T1151A 可作为散发性大肠癌的常规检测位点，对散发性大肠癌的筛选和诊断有重要意义。APEX 基因是碱基切除修复的重要成员,主要负责修
15、复烷化剂和氧化损伤造成的脱嘌呤/脱嘧啶位点。定位于 14 号染色体长臂(14q111.212)，是已知的人类基因组中最短的序列之一 ,从转录起始位点到多聚腺苷酸尾部约长 216 kb,编码由 318 个氨基酸组成的蛋白。APEX 基因是一种多功能蛋白，由氧化还原功能区和 DNA 修复功能区构成，其中氧化还原功能可以调节体内众多转录因子的DNA 结合活性 ,从而与细胞增殖、转化及细胞凋亡相关。APEX 的1247 位碱基位于氧化还原功能区，当 1247AG 转换可导致第 64位氨基酸由异亮氨酸( Ile) 变为缬氨酸(Val)，产生 I64V 变异体，可9能引起分子构象改变而直接影响其氧化还原活
16、性。Hadi 等9通过直接测序方法检测了 128 例具有种族代表性的美国正常人群该基因所有外显子中的多态性,发现 642V 的频率为 2/256 。汤显斌等10研究显示 150 例散发性大肠癌患者中 17 例发生 1247AG的多态性，认为 APEX A1247G 多态性在中国人散发性大肠癌中的频率远高于国外报道正常人群中的频率,可作为遗传流行病学研究的候选位点。本研究显示散发性大肠癌组中 APEX 的 A1247G 多态性基因频率（13/200） ，与正常对照组中基因频率 APEX A1247G（ 2/200）相比差异有显著性；与上述研究结果相近。大肠癌中 APEX 的 2197 位点是另一个较常发生变化的位点，通常存在TG的多态性。本研究的检测结果为散发性大肠癌基因频率 APEX T2197G（27/200）与正常对
