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1、针对毛细管中单分子的激光诱导荧光检测本研究的目的在于发展一个新型的激光诱导光谱检测方法来有效地检测流质（毛细管）中的单分子。通过一个氩离子在钛宝石激光器中调谐到铷原子阶跃线时产生 780.023 nm 的激光来激发在毛细管中 IR140 分子。关于流动中单分子的探测已经有多种实验方案了，包括有效的激光激发和荧光检测。 1-3 当分子经过聚焦的激光束时，它会在基本的电子状态和激发的电子状态之间循环，并且在每个循环懂释放光子，继而形成光子爆发。本研究阐释了单分子检测中的一个重要概念，即如何提高样本中所有分子的检测效率，而不仅仅是经过探针的分子。在以往关于单分子检测的实验中，大部分的分子没有经过激发
2、激光束，结果整体的检测效率较低。本文方法的独特之处在于将分子集中于一个毛细管中，用激发激光束来照射毛细管的整个内直径，并且用金属气过滤器吸收激光镜面散射。溶液状态中敏感荧光检测受到了光学和溶剂中噪声源的限制。通过将探针的体积降低到最可能小的水平，从本底发光和喇曼散射中隔离分子荧光的主要问题得到了解决。探针体积的减小可以通过光学上限制发光观察到的体积，或者物理上减小样本监禁的大小，或者同时采用光学和物理学上的方法。许多实验方法已经用到了单分子检测中的样本监禁，比如鞘流动单元和电动悬浮微滴法。通过让分子在样本流中流动，Keller 等人 1 利用激光诱导荧光（LIF）观察单分子中的光子爆发。运用电
3、动悬浮将单分子限制到微滴里面，Ramsey 等人 2 通过信噪比 3 检测到单分子。Soper 等人 3 证明了近红外分子（IR132）通过集中的高斯激光束的检测效率为 97%。通过一个非常简单的毛细管实验系统，我们运用二极管激光器产生了流动液体中的近红外荧光团，并且一次探针中检测了 103-104 分子。随着更多通用激光源的发展，这种基于毛细光的方案可以简便地运用到毛细管区电泳和毛细管液相色谱的实践分析，或者是任何包括非常小样本的分析技术中。但是，由于需要将空间探测的效率降低到单元值以下，进而最小化激光散射和本地噪音，单分子检测并未取得 100%的方法效度。本研究的重点是毛细管中单分子的有效
4、测量。这种方法的一大优势在于毛细管有利于分析极其细微的问题。另外，毛细管中极其细微的物理尺寸也要求柱上检测，这排除了护套流细胞和其他类型的外部流细胞的使用。除此之外，由于吸收情况在每种介质中时微不足道的，比如流动细胞物质、溶剂和大部分杂质，使用近红外激光作为激光诱导荧光的激发源足以引人注目。这是有好处的，因为从这些物质中产生的背景荧光不会限制了较低的检测底限。但是，将石英极微毛细管当做样本监禁进行单分子水平的研究还未开始，大部分原因源于识别由毛细管产生的高水平的激光镜面散射。运用 LIF 进行超痕量分析的一个非常重要的问题是控制激光镜面散射。激光镜面散射最理想的滤光器是在激光波长上展示全部的吸
5、收，同时保持发光带的透明度。金属汽过滤器（MVF）基于原子汽共振吸收有望成为排除窄带激光镜面散射的理想滤光器。MVP 是一个平行窗口里面带有惰性气体的加热石英细胞和激光波长上带有共振原子吸收线的挥发性金属。MVF 根据其组成部分，加热到合适的温度以便产生足够密度的金属原子来有效地吸收所有检测性的激光镜面散射。因此，MVF中的金属原子为激光镜面散射提供了近乎完美的滤光器，使得激光能够调谐到金属蒸汽的峰巅，激光线的宽度小于 MVF 的吸收带宽。跟传统的激光线控制过滤器相比，作为一种的单色仪和陷波滤波器，MVF 具备以下优点：低成本、高吸收、大信号采集固体角、窄吸收带宽、高信号吞吐量。最近，一些 M
6、VF 被证明能够有效地消除喇曼光谱的激光镜面散射。本研究目的在于开发一种新型的 LIF 光谱技术来有效地检测通过微小探针体积在毛细管中流动的近红外单分子（IR140） 。激光被调谐到 780.023 nm 的铷原子跃迁线，并集中于一个毛细管的表面。加热的铷金属蒸汽过滤器吸收了激光镜面散射的同时忽略了分子荧光。激发源是线宽小于铷原子吸收带宽的钛蓝宝石环形激光。探测器是带有高光子探测效率和低暗计数率的单光子雪崩光带二极管。由于金属蒸汽过滤器的重要性，Rb MVF 的传递特性得到了理论和实验的验证。当个别分子经过激光束时，加权二次加法过滤器被用来排除光子爆发。毛细管中单分子的检测被证明具有高度的方法
7、有效性。单分子检测的概念实验部分仪器设备 单分子检测设备的原理图如图 1 所示。来自于氩离子激光器的所有线（Spectra Physics 2060, Mountain View, CA）被用于在环形结构中形成一个单结构、可调谐的连续波钛宝石激光器（Schwartz Electro-optics, Inc., Orlando, FL） 。激光线宽小于 10 MHz。20 来自于钛蓝宝石水晶的微弱、宽带的背景荧光被一个窄带的通过干涉滤光片（0.18 nm fwhm at 780.1 nm, Omega Optical, Brattleboro, VT）所衰减。样本置于一个熔融石英毛细管柱中（内直
8、径 11um，外直径 139um，长 10cm；Polymicro Technology, Phoenix, AZ） ，机械微升注射泵控制流动（Harvard Apparatus 975, South Natick, MA）从已有的关于气密微升注射器解决和时间的介绍可知，测量体积流率接近于制造商给出的数值。为了达到稳定的慢速流率，测量之前通常需要等待 30 分钟。通过 100。 C 浓硫酸去掉毛细管表面上部分的聚酰亚胺可以创造一个“荧光窗口” 。激光通过一个 20 倍的激光扩展器（Melles Griot, Irvine, CA） ，并且通过毛细管的表面的摄像头（1:1.4，f= 55 mm）
9、进行聚焦。微位移阶段（Newport 461-XY-M, Irvine,CA）将刀片传到到激光束，并且在光电二极管上控制激光功率，毛细管上 1/e2 激光束直径被设置为 11um。由于集中激光束和毛细管内直径是相等的，系统在光学对准上很敏感。探针体积近似为一个汽缸，该汽缸的半径等于毛细管内半径，高度为集中激光束半径的两倍。根据毛细管的内直径和激光束的直径，探针体积约为1.05pL。运用显微镜物镜（40 x 0.65, Melles Griot, Irvine, CA） ，我们在准确的角度上收集到荧光和激光散射，后两者通过了 Rb MVF。为了在不同的围兜上对 Rb MVF 进行吸光度测量，毛细
10、管放在 45。 的镜子上来探测通过 Rb MVF 的激光束。购买得到的金属蒸汽细胞（Opthos,Rockville, MD）是一个在两端带有平行石英窗口的石英汽缸（长 10cm，直径2.5cm） 。剩余的铷金属 （500mg）被蒸馏成疏散细胞，以便有足够金属可以提供研究中所有温度下所需要的饱和金属蒸汽。200 托的氮气（室温）用作充填气体，继而熄灭原子共振荧光和加大 Rb MVF 的吸光带宽。为了防止 Rb 金属热蒸汽冲击把窗口打开，Rb MVF 放在一个装有热氮加热设备的汽缸里，如图 2 所示。由火炉（ Lindberg55035,Watertown,WI）加热的氮气在两个窗口中流动，并返
11、回 MVF 的主体，这个火炉的温度控制在1 。 C。通过这种方式，MVF 平面窗的温度将会高于 MVF 中心的温度，这样可以防止金属蒸汽在窗口上冷凝，否则会降低 MVF 的信号吞吐量和透光率。本研究中用到的 Rb MVF 有 1 年以上的时间功能完好。Rb MVF 后面有一个带通干涉滤光片（10 nm fwhm at 830 nm, Corion, Holliston, MA） 可以阻止溶剂中 860nm 的喇曼散射。利用第二个显微镜物镜（40x 0.65, Melles Griot, Irvine, CA） ，Rb MVF 的产物再次聚焦到一个光纤尾纤（100-pm core diamete
12、r, Canstar,ON, Canada）上，这是通过雪崩光电二极管预校准过的。雪崩光电二极管（EG&G OptoelectronicsCanada SPCM-200, Vaudreuil, Canada）是一个 830nm 上有 25%光子探测效率和每秒 25 暗技术率的单光子计数模块。 22 雪崩光电二极管产生的数字结果应用于啊电脑控制计数器计时器（Keithley Metrabyte CTM-05,Tauntor, MA)） ，以便进一步的数据分析。为了将钛蓝宝石激光调谐到 780.023nm 的 Rb 转一线上，Rb MVF 加热到 100。C，毛细管中的激光散射从 Rb MVF 转
13、移到雪崩光电二极管。接着，通过慢慢地调整腔内双折射滤光器， 钛蓝宝石激光被调谐到 Rb MVF 吸光率的最大值。为了进一步最大化了吸光率，利用腔内法布里珀罗校准器进行改善的调谐。吸光率最大值更像是一个高地而非仅仅是个峰点，因为法布里珀罗校准器可以在激光被调谐为截止波长和吸光率显著下降之前进行重要的调试。当 钛蓝宝石激光在谱线宽度为 10-MHz 的环形结构中操作时，780.023nm 的计算激光线宽度（fwhm）小于 0.081pm。 10试剂和化学品 IR140Exciton Chemical Co., Inc., Dayton, OH; chemical name, 5,5-dichlor
14、-ll-(diphenylamino)-3,3-diethyl-l0,12-ethylenethiatricarbocyanineperchlorate; CAS no.5365517-7;fw = 779在甲醇（ Optima grade, Fisher Scientific, Orlando, FL）中溶解。不同浓聚物下样本通过 1.510-5M 原液进行系列稀释所得，并在同一天进行分析。甲醇中 IR140 的荧光最大值是 780.023nm 激发下的 833nm。结果和讨论Rb 金属蒸汽过滤器的特征 鉴于在吸收激光镜面散射中的作用，Rb MVF 是毛细管单分子检测中非常重要的组成部分。铷
15、原子有两个主要的同位素：85Rb 和 87Rb，它们的自然比例为 0.727:0.273。 23 每种同位素有各自的超精细结构。铷的熔点为 39。 C，银币它可以在中度温度下产生足够的数密度原子。从每次电子变调的共振器强度和数密度来看，24Rb 的吸光剖面可以再不同条件下模拟。根据 Puerta & Martin 近似， 25 图 3 展示了 Rb 在 27、50和 100。 C 下的 Voigt 吸收剖面，即高斯和洛伦茨剖面的卷积。如图 3 所示，细胞温度的上升对吸光率有着显著的影响，即反应了提高的 Rb 金属蒸汽数密度。每个剖面的峰值不止一个是因为整体调谐的超精细结构。沃伊特吸光带宽约为
16、780.023nm 上的 21pm，接近于测量值。26 合乎理想的是，一旦窄激光线被调谐到 100。 C Rb MVF 的吸光峰值，可以得到成千的吸光率。与中性密度滤光片校准之后，通过 Rb MVF 的透光信号可以再不同的温度下进行测量。测量得到的透光率就转换为吸光率。结果如图 4 所示，小黑点表示各个温度下的激光散射的吸光率。170 。 C 上大约 8 的吸光率最大值受到背景为钛宝石水晶的微弱、宽带激光的影响。单分子检测 为了以近似于统一的测量效率检测单分子，毛细管必须完全在集中激光束的照射中。Dovichi 等人 16 和 Soper 等人 13 介绍过样本流中抛物线型流的计算方法，毛细管中分子的一般线性流速可以通过体积流率和毛细管的横截面积（9.5x 10-7cm2）计算得到。探针体积上分子的平均传输时间可以通过以下方程计算而得： 16运输时间约为 0.8ms，注射泵的体积流率被设置为 0.061uL/min。探针体积中分子传输时间的误差可能来自于直径内小毛细管的不确定性、圆柱毛细管中变形的激光束形状和
