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1、1探讨结直肠癌与 DNA 错配修复基因 hMSH2 的关系【关键词】 探讨 结直肠癌 DNA 错配修 复基因 hMSH2DNA 错配修复基因(DNA mismatch repair gene)首先在细菌和酵母中发现,在人类基因组中也存在类似物。这种基因的突变在人类遗传性非息肉型结直肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC)和散发性结直肠癌（ Sporadic Colorectal Cancer,SCRC）的发病过程中起重要作用。DNA 错配修复基因既非癌基因,也非抑癌基因, 是另一类肿瘤相关基因,这是继癌基因与抑癌基因之后,在肿瘤发病
2、的分子机制方面的又一重大进展1。错配修复基因（MMR ）是一类和人类的错配修复反应有关的基因， 包括 hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMSH1 和hPMSH2 等基因。其中，又以 hMSH2 为尤为重要。本文现就错配修复基因 hMSH2 及其与结直肠癌的关系综述如下。1 hMSH2 基因结构和功能hMSH2 是第一个被分离到的人类错配修复基因,该基因与细菌的 Mut S 同源,位于 2p2122,其基因 DNA 全长约 79kb(不包括启动子),cDNA 全长 3111 bp,有 16 个外显子，并含有 2727 bp 的2开放阅读框架,翻译后编码一种由 909 个氨基酸组
3、成的蛋白质2;hMSH2 蛋白在错配修复过程中通过核苷酸聚合酶而起作用,它失活后可引起复制错误的累积,从而引起突变表型。Kolodner 等3发现有一种与细菌 MutS 基因同源的人类错配修复基因 hMSH2,位于染色体 2,D2S123 标志物的附近。将突变的 hMSH2 克隆入 E.coli 可以引起基因标志物突变率的增加。最后,他们表明 26 名散发的结直肠癌患者中的 7 名包含 (CA)n 二重重复复制,且该 7 位患者中的 2位有 hMSH2 基因突变。核苷酸错配发生于三种情况:即 DNA 的物理损伤、DNA 复制过程中核苷酸的错误掺入以及基因重组。DNA 聚合酶偶尔能催化不能与模板
4、形成氢键的错误碱基的掺入,这种复制错误通常由聚合酶35的校对功能立即予以纠正,再开始下一个核苷酸的聚合反应。在某些特殊条件下,DNA 聚合酶将极少的错误碱基遗留在 DNA 链上而未予以纠正,因此,DNA 的错误修复必须有 MMRS 参与, 它在修复过程中高度特异的识别错配碱基,并在此基础上对其进行双向切出,此时同样也依赖于 DNA 复制时模板链和新生链的甲基化程度的差异。错配修复反应既可修复 DNA 复制过程中出现的碱基错配,又可消除由于含简单重复序列的同源序列间遗传重组出现的不配对序列,这样可有效的防止 DNA 复制差错的产生。在 DNA 错配修复中,hMSH2 蛋白质首先与 GT结合(GT
5、 3Binding Protein,GTBP)形成一种称为 hMSH2二聚体复合物,并结合到 DNA 碱基错配区, 然后与 hMSH1 和 hPSH2 基因形成的二聚体 hMut L结合, 其中异源二聚体 hMut L起到识别带有缺口的新生 DNA 链的作用4。hMut L与 hMut S结合到DNA 错配区后 ,即可激活与 Mut H 蛋白有关的 GATC 核酸内切酶,这种酶可切出未修饰的甲基化 GATC 序列5。依赖于 Mut S、Mut L 及 DNA 解旋酶(Mut U)的协同作用,随着新生链错配区的切出,整个修复反应即被启动5。总之, 修复反应包括切出含碱基错配区的DNA,被切出区域
6、的重新合成以及连接等三个步骤。2 hMSH2 基因在结直肠肿瘤中的突变2.1 SCRC 结直肠癌分为遗传性结直肠癌和 SCRC，其中80以上的结直肠癌为 SCRC。结直肠癌的发生是一个涉及多基因改变的多步骤的累积过程。基因不稳定性在结直肠癌发生中起重要作用。这可分为二种不同形式,即染色体不稳定性(chromosome instability),亦称肿瘤抑制途径(suppressor pathway)和微卫星不稳定性(mirosatellite instability,MSI),也称 MSI 途径(MSI path way)。前者与 Fearon 等提出的模式相似, 由于染色体的不稳定性,使染色
7、体大片段丢失、易位和重排,导致大量异倍体细胞;而在后者,由于错配修复基因突变, 使单核苷酸水平突变率增加,导致广泛的MSI。文献6，7报道约 1015的 SCRC 表现为 MSI，90的4HNPCC 可检测到 MSI。根据 MSI 检出位点的多少, 可将散发性结直肠癌分为高频率MSI(MSIH),低频率 MSI(MSIL)和无 MSI(MSS)8,MSIH结直肠癌表现为高频率的 TGFR 、IGFR 、BAX、hMSH3 基因的移码突变和低频率的 APC、MCC 和 DCC 的杂合丢失,而 MSIL和 MSS 结直肠癌却表现为相反结果。最近研究发现，除上述基因改变外,MSIH 结直肠癌还表现为
8、错配修复基因 hMSH2 和 hMLH1错配修复基因表达的下调等,而 MSIL和 MSS 结直肠癌则无此表现9。在 MSI 的临床表型方面,MSIH 多见于结直肠多发癌 ,多位于右半结肠,组织学上多为低分化型, 少有淋巴结转移,多数认为恶性程度较低, 预后较好。以上说明 MSIH散发性结直肠癌无论在临床病理特点还是在基因改变方面均与 MSIL和 MSS 癌有明显不同。在散发性结肠癌患者细胞中检测到有 DNA 复制差错阳性(RER+)的出现 ,一般散发性结肠癌患者 DNA 中 RER 阳性检出率约为10%16%, 并且在一些具有微卫星 DNA 不稳定的散发性结肠癌患者细胞中亦筛查出有 MMR 基
9、因突变的存在。Thibodeau 等10用位于染色体 5、8、15、17、18 上 11 个微卫星位点测 508 例SCRC（MSI 30%为轻度 RER+，30% 为重度 RER+） ，结果：重度 RER+SCRC 为 16.1%，轻度 RER+为 21.3%，RER-SCRC 为62.4%。分析 RER+表型与患者临床病理特征的关系，轻度5RER+SCRC 患者其临床病理特征与 RER-SCRC 患者相似；重度RER+SCRC 与其他两型相比，肿瘤患者多为女性，肿瘤多位于近段结肠、为二倍体肿瘤、发病年龄较低及多处于 Ducks 分期的后期。对其中 188 例 SCRC 用免疫组化技术研究
10、hMSH2，hMLH1 表达情况，结果显示，RER-SCRC（129/188）及轻度RER+SCRC（17/188） ，hMSH2，hMLH1 蛋白表达均正常，42例重度 RER+SCRC 中，38（90%）例 hMSH2 正常，而缺乏hMLH1 表达， 2 例正常表达，仅 2 例 hMSH2 不表达，认为hMSH2 表达异常在重度 RER+SCRC 的发病机制中起重要作用。2.2 HNPCC 是一种特殊类型的结直肠癌，是由于 DNA 错配修复基因(MMR)发生胚系突变所致的一种单基因的显性遗传性疾病，又称 Lynch 综合征，约占结直肠癌总数的 15 18 。本病约占家族性结直肠癌的 50%
11、,采用阿姆斯特丹标准后,占全部结直肠癌的 1%5%11，12。国内报道发生率占同期收治结直肠癌病例的2.4%。HNPCC 以男性多见,男女之比约为 2.51。HNPCC 是一种常染色体显性遗传性疾病,外显率高达 80%85%。1993 年Aaltonen 等1首先研究发现，遗传性非息肉性结直肠癌中存在一种 DNA 错配修复基因，该基因的改变可引起微卫星不稳定性（MI） 。现在已分离和鉴定的与 HNPCC 有关的基因主要有hMSH2、hMLH1、hPMS1 和 hPMS2,他们分别定位于染色体2p2122、3p21、2q3133 和 7p22。目前已检测到 hMSH2 的6突变为 MMR 中最易
12、检测的突变 ,其突变检出率为 21%54%。这种突变主要为单碱基的改变和由于碱基的缺失和插入引起的移码突变, 导致下游提前出现终止密码, 而使蛋白截断或功能缺失。hMSH2的突变主要位于其后面的外显子上。研究证明13,14,在 HNPCC 发病中起主要作用的是 hMSH2 和 hMLH1 基因, 大约半数的 HN PCC 可检出 hMSH2 或 hMLH1 基因突变。国内王亚平15等分析了 HNPCC 患者外周血细胞 DNA 错配修复基因 hMSH2, hMLH1的突变，并证实了 HNPCC 的发生与错配修复基因的突变密切相关。袁瑛等16 分析了 29 个 HNPCC 家系中， hMSH2 基
13、因的突变明显高于对照组。hPMS1 和 hPMS2 是细菌错配修复基因 mut L 的同源物, 分别定位于 2q3133 和 7p22,各包含一个 2795bp 和2586bp 的开读框架。当一个家族所具备的临床病理特点17越多,发生 HNPCC 的可能性越大。再此应强调的是,要重视 MMR 基因检测在诊断中的作用, 即使只具有一个特点17 的家系也是如此。如果一个家系具有三项特点17 以上, 或一个家系有 3 人具有特点17,即为 HNPCC 高危家系, 应进一步进行 MMR 基因突变分析。由于突变分析技术要求较高, 操作比较繁杂, 花费也大 ,因此如何选择基因分析的病例就显得非常必要。一般
14、认为,对低危家系的结直肠癌先行 MSI 检测, 然后再对MSI+病例进行突变分析。72.3 结直肠腺瘤和溃疡性结肠炎相关性结直肠癌 MMR 基因的突变导致 MMR 系统的缺陷 ,可引起广泛的体细胞突变和 DNA 复制错误,MMR 功能缺失也可导致一些抑癌基因突变率的增加和突变的积累而促进肿瘤的发生18。周琪等19发现 hMSH2 基因蛋白阳性表达率从正常组织、腺瘤不典型增生、腺瘤癌变到腺癌逐渐降低, 提示在腺瘤阶段已经有 MMR 的基因的突变或功能异常,并随其恶性程度的增加,MMR 基因的突变频率也逐渐升高。提示 MMR 基因的突变,尤其是 hMSH2 的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。
15、结直肠腺瘤不但在 HNPCC 中发生, 而且有很多证据说明 HNPCC 即发生于腺瘤基础上。HNPCC 相关腺瘤与其他腺瘤有明显不同 ,可以是单发,也可以是多发, 组织学上多为绒毛状腺瘤,常表现为明显的异型性, 可迅速由腺瘤发展为腺癌, 因此亦称为侵袭性腺瘤(aggressive adenoma)。有关分子生物学研究亦支持 HNPCC 相关腺瘤具有侵袭性的观点。大部分 HNPCC 腺瘤存在基因不稳定性 ,检测腺瘤 MSI是发现 HNPCC 的有用方法。由于近来 HNPCC 有关基因的鉴定,我们可对基因携带者进行分子遗传学诊断,这将使高危人群的数量减少一半。Russell 等20发现错配修复缺陷
16、造成的微卫星 DNA 重复序列数不稳定与 HNPCC 由腺瘤向癌恶性转变有关。腺瘤阶段 ,微卫星DNA 重复序列数改变的比例明显低于癌阶段。这说明大多数HNPCC 在良性的腺瘤阶段已有部分基因向不稳定发展,微卫星 DNA重复序列数改变速率越快,腺瘤恶变的可能性就越大。8溃疡性结肠炎个体结直肠癌发生率比一般人群高 20 倍。Kern 等21 证明微卫星 DNA 重复序列数的不稳定在溃疡性结肠炎的异形区和结肠癌细胞中都存在。人类 hMSH2 基因中一个内含子剪接位点的碱基 T 被 C 替代后,会大大增加 8 年以上溃疡性结肠炎患者癌变的可能性。Cawkwell 等22在 38 例 UCACRC 中发现,有 1例(2. 4%)存在 hMSH2 蛋白表达缺失,该例亦表现高水平的 MSI。王赫等24在研究中发现,
