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1、1我国药用植物次生代谢产物功能基因研究概况【摘要】 综述了近年来我国药用植物次生代谢产物功能基因的研究方法和内容，着重介绍了萜类、黄酮类、生物碱类、酚类、多糖类、凝集素等次生代谢产物合成相关功能基因的研究现状，对药用植物次生代谢产物合成相关功能基因的应用前景作了介绍，为今后药用植物功能基因的大规模研究和利用提供借鉴。 【关键词】 药用植物 次生代谢产物 功能基因Abstract：The content and methods of our countrys latest functional genomics study of medicinal plant secondary metabol
2、ism were reviewed, by focusing on the synthesis of terpinoids, flavonoids, alkaloids etc. The research progress and potential application in this new area were also commented.Key words： Medicinal Plant; Secondary metabolism; Functional genomics; Research progress1995 年生物学家提出“后基因组(postgenome)” 的概念，即在
3、基因组静态的作图、碱基序列分析基础上转入对基因组动态的生2物学功能的研究。随着人类基因组计划(HGP)的顺利进行，基因组学的研究从结构基因组学(structural genomics)开始过渡到功能基因组学(functional genomics)，结构基因组学代表基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨遗传、物理图谱为主；功能基因组学代表基因分析的新阶段，是利用结构基因组学提供的信息，发展和应用新的实验手段系统地研究基因功能，它以高通量、大规模实验方法及统计和计算机分析为特征。目前人类、酵母的功能基因组研究已全面展开，植物的功能基因组研究起步较晚，现正处于结构基因组学和功能基因组学并重的时代
4、，但近几年植物功能基因组学研究得到了迅速发展13 。1 药用植物次生代谢产物合成相关功能基因组学研究方法植物在长期进化过程中，逐渐形成了一些适应环境的生理生态功能, 其中之一就是根据初生生长的需要产生各种类型的次生代谢产物。次生代谢产物是植物在长期进化中与其生存环境相互作用的结果,既能够在植物体内积累，抵御病原微生物等的侵害，又在植物的整个代谢活动中占有重要地位4 。药用植物功能基因研究是从功能基因入手阐明药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制，其中主要涉及到次生代谢产物生物调控的关键酶系的结构编码基因和其他功能基因。研究中可能应用3的分子生物技术有植物的表达序列标签(EST)和 cDNA
5、 文库筛选；药用植物功能蛋白质组研究；特定代谢时期细胞功能簇(CRC)分析和功能蛋白质组表达图谱用于基因组功能提示的可行性；基因表达指纹(GEF)；基因表达系统分析(SAGE)；cDNA3端限制酶切片段显示；分子指数的 RNA 指纹 (MI)；消减杂交(SSH)；基因芯片等。这些分子生物技术可应用于药用植物次生代谢调控机制研究，功能基因和次生代谢酶基因的克隆、表达和鉴定等5 。2 药用植物次生代谢产物相关功能基因组研究概况2.1 萜类物质萜类化合物(terpenoid)是一类由异戊二烯(soprene)为结构组成单元的天然烃类化合物的统称，在自然界中分布广泛、种类繁多、结构多样。迄今为止大约有
6、 22 000 种萜及萜类衍生物的化学结构已被鉴定，它们不仅在植物的生命活动中扮演重要的作用，而且还被广泛地应用于工业、医药卫生等领域6 。肖明贵等7从曼地亚红豆杉中提取分离出 mRNA，然后根据已知植物的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因(GGPPS 基因)DNA序列保守区设计特异简并引物。RT-PCR 获得了一条大小约 600 bp的扩增谱带,回收该特异谱带并进行 TA 克隆，发现该序列属于GGPP 合成酶的片断，与加拿大红豆杉和北美冷杉的 GGPP 合成酶相应区段的氨基酸序列一致性为 98%和 86%。蛋白质序列分析发现4该序列含有一个特征的异戊二烯合成酶保守的结构域。进化树分析表明，曼地
7、亚红豆杉 GGPPS 在进化上位于植物类，靠近古细菌类。冯磊（中国红豆杉紫杉烷 13-羟基化酶基因的克隆及表达.曲阜师范大学 2006 硕士研究生学位论文）从中国红豆杉中克隆得到紫杉烷 13-羟基化酶基因序列，长为 1 848 bp，阅读框(ORF) 编码区为 1 458 bp，编码 485 个氨基酸，分子量 54.7 KD，该基因与东北红豆杉紫杉烷 13-羟基化酶有 97%的相似性。与其他已克隆的红豆杉羟基化酶有 54%60%的相似性。该基因编码一膜锚定蛋白，推断所克隆基因编码一个执行生物合成功能的 A 类 P450 蛋白。周明兵等8以杜仲树叶总 RNA 为模板扩增出杜仲法呢基焦磷酸合酶基因
8、(Farnesyl PyrophasphateSynthase, EuFPS), cDNA序列全长 1 271 bp,开放阅读框共编码 320 个氨基酸残基, 其核酸序列与拟南芥、银胶菊和巴西橡胶树 FPP 合酶的序列同源性分别为81%，87%和 82%。刘彦（青蒿生物合成相关基因的克隆、大肠杆菌表达与分子分析.中国科学院研究生院 2006 博士学位论文）从青蒿高产株系001 中克隆出全长 1 886 bp 的倍半萜合酶 cDNA，其氨基酸序列5与烟草马兜铃烯合酶、蕊若岩兰螺旋二烯合酶、棉花杜松烯合酶的一致性分别为 39%，38%和 41%；与青蒿柏木脑合酶、紫穗槐二烯合酶和一个推测的倍半萜合
9、酶克隆 cASC125 的一致性为50%，48%和 59%。克隆了一个 1 539 bp 全长鲨烯合酶 cDNA，青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为 70%，77%，44%，39%。赵玉军等9从青蒿高产株系 025 中的 cDNA 文库中克隆到了一个编码青蒿法呢基焦磷酸合酶（AaFPS1）的 cDNA（af1） ，序列分析表明，这一 cDNA 编码一个含 343 个氨基酸残基的蛋白质，分子量为 39 KD，推导出的氨基酸序列与来自其他植物、哺乳动物和酵母的 FPS 相似，也包含异戊烯基转移酶和聚异戊烯基合酶所共有的 5 个保守域，此 cDNA 在大肠杆菌中的
10、表达产物表现出明显的FPS 酶学活性。刘水平等1012从人参根组织中分离总 RNA，使用 RT-PCR 扩增出人参皂苷生物合成相关基因 GBR6 开放阅读框（ORF ）cDNA 片断，并将其定向克隆入原核高效表达载体 pQE30，阳性克隆经 Bam1 和 Pst1 双酶切鉴定、测序验证与已知的 GBR6 ORF 序列完全一致，成功构建了 pQE30- GBR6ORF 融合原核表达载体。陈莉（三七主要有效成分三萜皂苷合成关键酶 FPS 基因的克6隆及序列分析.广西医科大学 2005 硕士研究生学位论文）对三七三萜皂苷合成关键酶法呢基焦磷酸合酶（FPS）的基因进行克隆，cDNA 序列全长 1 40
11、9 bp，开放阅读框共编码 343 个氨基酸残基，氨基酸序列与积雪草、银胶菊、青篙、山艾树的 FPS 氨基酸序列的同源性分别为 95%，87%，86%和 86%，核酸序列同源性则分别为 81%，66%，68%和 66%。陈珅（三七三萜皂苷合成途径鲨烯环氧酶基因的克隆及初步表达.广西医科大学 2006 硕士研究生学位论文）对三七三萜皂苷合成关键酶鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SE ）的基因进行了克隆， cDNA 序列长 1648bp，分子量约为 64KD，开放阅读框共编码 537 个氨基酸残基，氨基酸序列与人参、管状苜蓿、毛曼陀罗、亚洲栽培稻、番茄、拟南芥和甘蓝型油菜的同源性
12、分别为97%，76%，73%，71%，70%，70%和 45%；核酸序列的同源性分别为 97%，63%，62%，62%，62%，60%和 48%。朱华（三七鲨烯合酶基因的克隆及其功能的初步研究.广西医科大学 2006 硕士研究生学位论文）对三七鲨烯合酶（SS）基因及 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因进行体外克隆，cDNA 序列全长 1270bp，开放读码框共编码 415 个氨基酸残基，氨基酸序列与人参、积雪草、青蒿、拟南芥、水稻的 SS 氨基酸序列的同源性分别为 98%，89%，81%，78%，71%，核苷酸序列的同源性分别为 98%，88%，77%，73%，66%。获得了三七 GAPD
13、H 基因的部7分 cDNA 序列，长 627bp，与拟南芥、烟草、人参的 GAPDH 氨基酸序列的同源性分别为 91%，93%，95%。核苷酸序列的同源性分别为 82%，84%，85%。杜鹃（蹄叶橐吾萜类化合物合成相关基因克隆及功能研究.吉林大学 2007 博士学位论文）从野生蹄叶橐吾中克隆出萜类化合物紫菀酮形成关键酶 HMG-CoA 还原酶家族(HMGR、HMGR2)，成功构建了 HMGR 基因植物双元高效表达载体 pBSHMGR，获得了转化效率极高的转基因蹄叶橐吾植株。转基因植株及其野生型对照蹄叶橐吾紫菀酮含量 HPLC 测定结果表明，HMGR 基因的超表达增加了紫菀酮在转基因植株根、茎中
14、的积累。刘长军等13从亚洲棉中分离得到倍半萜棉毒素合成相关酶法呢基焦磷酸合成酶（FPS ）的 cDNA。序列分析表明，该 cDNA全长 1280bp，开放阅读框共编码 342 个氨基酸残基，分子量为 39 kD，氨基酸顺序与拟南芥和青蒿的 FPP 合酶序列同源性为 78.9%和 80.7%。2.2 黄酮类物质黄酮类化合物是植物在长期的生态适应过程中为抵御恶劣生态条件、动物、微生物等攻击而形成的一大类次生代谢产物。它们是广泛分布于植物界的碳基本骨架化合物，在许多植物的花、果和叶中大量分布，目前发现的四千余种的黄酮类化合8物可以分为以下几种：黄酮醇(flavonols)、黄酮(flavones)、
15、异黄酮(isoflavones)和花色素苷(anthocyanins) 14 。程水源等15从银杏叶中克隆得到了控制银杏叶中黄酮类化合物代谢途径中关键酶苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammo-nia-lyase, PAL)基因的部分序列，长度 862 bp，氨基酸序列与长白松、海岸松、火炬松和亮石杉 PAL 基因的氨基酸同源性分别为93%，93%，91%和 90%。Southern 杂交结果表明银杏 PAL 是一个多基因家族。崔光红等16研究丹参毛状根不同时期的基因表达谱 ,将 45, 60 d 丹参毛状根分别与 30 d 材料进行杂交，得到 203 个差异基因。测序后得到 17
16、2 条 EST，拼接聚类后形成 114 个 Unigene，其中功能已知基因 62 个。得到一系列次生代谢相关基因如细胞色素P450、二萜合酶等基因片段。蔡文伟（海南龙血树血竭生物合成相关基因的分离.华南热带农业大学 2006 硕士学位研究生论文）以经诱导物诱导处理刚产生血竭和未经诱导物处理的海南龙血树组培苗为材料，利用抑制消减杂交（SSH）技术构建了龙血树血竭生物合成相关基因的差减cDNA 文库，分离到与信号转导相关的 cDNA 片段 5 个，转录翻译相关蛋白 cDNA 片段 5 个，物质能量代谢酶类 cDNA 片段 12 个。9段小瑜等17从大豆总 RNA 中分离了合成异黄酮的关键酶异黄酮合酶(isoflavone synthase，IFS)基因，含 1 583 个核苷酸,与已报道的大豆异黄酮合酶基因的核苷酸同源性为 92%。杨丽（百合查尔酮合成酶基因（CHS）及其启动子的克隆与分析.西北农林科
