大豆根瘤菌的筛选及分离鉴定

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1、1大豆根瘤菌的筛选及分子鉴定韩孝强（天津农学院 农学系）1 前言根瘤菌是可以与豆科植物共生形成根瘤，将空气中的氮还原成氨，提供植物营养并能促使植物异常增生的一类革兰氏阴性菌。如根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的多态细胞，称为类菌体 1。常制成细菌制剂即一种生物肥料在田间施用，作为作物或牧草增产的一种手段。美国、澳大利亚、新西兰、日本、意大利、奥地利、加拿大、法国、荷兰、芬兰、泰国、韩国、印度及非洲的一些国家，至少有 70 多个国家研究、生产和应用豆科根瘤菌，不仅面积不断扩大，而且应用的豆科植物种类也日益繁多。在美国、巴西等大豆种植的主要国家，根瘤菌接

2、种率达到 95%以上 2。世界各国一直在研究与豆科作物及其品种相匹配的优良根瘤菌生产用菌株，根瘤菌剂产品在稳步提高 3。我国微生物肥料的研究始于 20 世纪 40 年代，其研究与应用已有几十年的历史，在我国的农业生产中起了非常重要的作用。最早研究应用的是根瘤菌制剂，代表和奠基人有张宪武先生、陈华癸院士和樊庆笙先生等 4。众所周知，大豆是富含蛋白质的一种作物，构成蛋白质的主要元素就是氮，而空气有 80%都是由氮气组成的，根瘤菌正是利用了这种最廉价的原料来满足了大豆生长过程中氮元素的需要 5。而且根瘤菌产生的氨态氮没有环境污染，吸收率相当高，使用过程中没有氮流失，而人工施用化学氮肥流失率往往大于

3、50%，且氮肥为产酸肥料，施用后会造成土壤酸化问题 6。因此使用了根瘤菌后可以不施或大量减少化学氮肥的用量，在显著提高亩产量的同时还能减少因使用化肥对土壤结构造成的破坏和对水源的污染，节省能源、改良土壤、实现可持续发展的目标 7。传统的微生物系统分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定 8。但近几2十年来，随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展，给传统微生物分类鉴定带来了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中己得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定 9。细菌含有 3 种不同的 RN

4、A，即 mRNA、rRNA 和 tRNA。它们分别行使着不同的功能，其中 rRNA 可将遗传信息得以表达，转译成蛋白质，它在所有细菌中都有一定的碱基序列和空间结构。不同种类的细菌，rRNA 在不同位点上的序列改变频率也不同。因此，这些分子可作为种系标记物用以鉴别不同的细菌。原核生物的核糖体由 50S 和 30S 两个亚基组成，而 30S 亚基又包含 3 种类型的 rRNA，即23S、16S 和 5S rRNA，它们分别含有约 2900、1500 和 120 个核苷酸。5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是 16S rRNA

5、 的两倍，分析也较困难 10。 16S rRNA 为核糖体小亚基中的的RNA，而 16S rDNA 为编码该亚基 RNA 的基因。从上世纪 70 年代以来，科学家们因 16S rRNA 的保守性，对其进行了大量研究工作，现在已对 16S rDNA 序列有了清晰的认识 11。 16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基 rRNA(16S rRNA)的基因,长度约为 1500 bp，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟” ，其序列包含 10 个可变区(variable region)和与之相间的 11 个恒定区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育

6、密切相关，是生物的种属鉴定和系统发育的重要分子基础。目前，rRNA 分子己经成为一个分子指标，广泛地应用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究，加上大量已知微生物的 DNA 都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统，可以通过对未知微生物DNA 序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的鉴定分类的目的。从而精确地揭示了微生物种类和遗传特征的多样性 12。近几年来，我国的微生物肥料生产发展较快，但在生产应用中反映出一些问题，如有的菌种质量不好，肥效不高，微生物肥料的品种也不多 13。发展微生物肥料，重要的一个方向是要应用现代生物技术筛选出高效、抗逆、强竞争存活能力的

7、菌株，以适应微生物肥料发展的需要 14。本文先从未喷洒，喷洒国产和喷洒加拿大菌剂后的三种大豆根的根瘤中分离出革兰氏阴性菌株，再利用 16S rDNA 分子鉴定筛选出慢生型大豆根瘤菌，与原菌剂中的菌株比较同源性，验证该菌株是原菌剂中的根瘤菌，从而证明该菌株可以引起大豆根结瘤。32 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 大豆根大豆根 1：未喷洒任何根瘤菌剂所生长的大豆根。大豆根 2：喷洒国产根瘤菌剂所生长的大豆根。大豆根 3：喷洒加拿大根瘤菌剂所生长的大豆根。三种大豆根均来自黑龙江九三试验田。2.1.2 培养基YEM 培养基：甘露醇 10 g，K 2HPO4 0.5 g，MgSO 47H2O 0.

8、2 g，NaCl 0.2 g，酵母粉 0.4 g，蒸馏水 1 L，pH 6.8，121 灭菌 30 min。2.1.3 主要试剂2.1.3.1 主要试剂盒细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 购 自 北 京 康 为 世 纪 生 物 科 技 有 限 公 司 ，试剂盒组成为：Buffer GTL， Buffer GL， Buffer GW1，Buffer GW2，Buffer GE。2.1.3.2 主要试剂及其配制结晶紫染液：结晶紫 1 g，95%乙醇 20 mL，1%草酸铵水溶液 80 mL；将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混和。路哥氏碘液：碘片 1 g，碘化钾 2 g，蒸馏水 300

9、mL；将碘与碘化钾先进行混和，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL。沙黄复染色液：沙黄 0.25 g，95%的乙醇 10 mL，将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释至 100 mL。0.5 mol/L EDTA： 称取 186.1 g Na2EDTA2H2O，置于 1 L 烧杯中，加入约 800 mL 的去离子水，充分搅拌，用 NaOH 调节 pH 值至 8.0（约 20 g NaOH，pH 值至8.0 时，EDTA 才能完全溶解） ，加去离子水将溶液定容至 1 L，适量分成小份后，高温高压灭菌，室温保存。冷 无 水 乙 醇 ： 将 无 水 乙 醇 置 于 -20

10、 保 存 。TAE 电 泳 缓 冲 液 ：（ 1） 50贮 存 液 ： Tris 碱 24.2 g； 冰 醋 酸 5.71 mL； 0.5 mol/L EDTA（ pH 8.0） ， 10 mL； 加 60 mL 蒸 馏 水 ， 剧 烈 搅 拌 ， 加 蒸 馏 水 至 100 mL， 浓 盐 酸 调 pH至 8.0。（ 2） 1工 作 液 ： 将 以 上 贮 存 液 用 蒸 馏 水 稀 释 50 倍 。 做 电 泳 缓 冲 液 。450%甘 油 ： 取 甘 油 和 蒸 馏 水 等 比 例 混 合 ， 121 灭 菌 20 min 备 用 。goldviewTM 核 酸 染 料 ： 用 量 筒

11、量 取 350 mL 1TAE， 加 入 100 L goldviewTM， 混 合 均 匀 后 ， 妥 善 保 存 。2.1.3.3 其他试剂Taq 酶、10Buffer、dNTPs、Marker DM2000 等购自北京康为世纪生物科技有限公司。PCR 扩增的引物购自华大基因。电泳所用 Loading Dye 购自东洋纺生物科技有限公司。2.1.4 主要仪器 FA2004 电子天平 上海精科天平TGL-16G 高速台式离心机 上海安亭科学仪器公司BCM-1000A 生物洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司XW-80A 涡旋混合器 江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司MCO-15A CO2 培

12、养箱 SANYO Electric Co.Ltd.可调试移液器 热电（上海）仪器有限公司Motic Digital Microscope OlipusHNY-2102 INCUBATOR SHAKER 天津市欧诺仪器仪表有限公司DYY-2C 型电泳仪 北京六一仪器厂130XUN 型 立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂多 用 全 封 闭 电 炉 河北省黄骅市振兴电器仪器厂WD-9403F 紫外仪 北京六一仪器厂BCD-241WE/Y 冰 箱 青岛海尔特种电冰箱有限公司HH-Z4 型 恒 温 水 浴 锅 郑州长城科工贸有限公司Tgradient 梯 度 PCR 仪 德 国 Biom

13、etra 公 司MG-5005D 微波炉 天津乐金电子电器有限公司KYC 100C INCUBATOR SHAKER 上海福玛实验设备有限公司2.2 实验方法2.2.1 大豆根根瘤预处理2.2.1.1 大豆根预处理先将取回的大豆根于清水中浸泡数分钟，使根部泥土松动。在水中轻轻摇晃。依次重复 3 次，直到根部泥土清理干净为止。然后室温晾干，拍照，比对。52.2.1.2 根瘤的处理剪取较大的根瘤。剪取根瘤时注意将根瘤所在的根部 0.5cm 左右一同剪取。 （防止根瘤与根的连接部位污染） 。将剪取的根瘤在清水中冲洗 3-4 次去除缝隙中的泥土，在超净工作台内再用 70%酒精擦洗，并在其中浸泡 3 分

14、钟，用无菌水冲洗，除去表面的酒精。用灭过菌的镊子轻轻取下根瘤，灭过菌的小刀将根瘤切开。切面贴于固体 YEN培养基上，并划线。2.2.2 根瘤菌的纯化和形态观察2.2.2.1 根瘤菌剂中菌株的纯化和菌落形态观察依据上述方法依次处理三种根瘤。每种根瘤取一个完整根瘤放于 YEM 培养基上作为阴性对照。将平板倒置与 30恒温培养。每 12h 观察一次。待长出单菌落后，挑取单菌落与新的 YEM 培养基上分区划线。重复该步骤，知道平板上出现的菌落形态单一为止。观察出现单菌落的形态。从大豆根 1 中分离出的单菌记为c11，c12，c13 ，c14，c15，从大豆根 2 的根瘤中分离出的单菌记为 A12，A1

15、4 ，从大豆根 3 的根瘤中分离出的单菌记为 c21，c22 ，c23。2.2.2.2 革兰氏染色制片：在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用灭菌的接种环挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合成悬液；固定：在酒精灯火焰外层快速地来回通过 34 次，完全干燥；染色：结晶紫染色 1 min 后水洗；媒染：加路哥氏碘液作用 1 min 后水洗、吸干残液；脱色：用 95%乙醇脱色直至滴加的酒精不成紫色为止；水洗：用水滴洗去乙醇，吸干残液；复染：加 0.5%的番红染色液染色 1030 s 后，用自来水冲洗；干燥后置于显微镜下观察染，显现紫色的为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。为了使实验结果更可靠，将大肠杆菌（

16、革兰氏阴性菌） 、慢生大豆根瘤菌以及枯草芽孢杆菌（革兰氏阳性菌）制片于同一载玻片上，进行以上操作。选取最后的革兰氏阴性细菌进行一下步骤。2.2.3 纯化菌株基因组的提取取 2.2.2.3 中革兰氏阴性菌株的培养物少许分别接种在 YEM 的液体试管中。置6于 30 ，150 rpm 摇床培养，至培养液混浊。按照基因组提取试剂盒中操作说明提取选取的革兰氏阴性菌株。革兰氏阴性菌提取基因组的步骤：对以上培养液进行镜检，确定无杂菌后取适量的菌液加入 1.5 mL 离心管中离心，7500 rpm，10 min。尽量除净上清液。向离心管中加入 200 L 的蛋白酶 K，涡旋混匀。56 水浴至菌体完全裂解。期间每隔一段时间颠倒混匀。涡旋震荡 15 s，向其加入 200 L 的 Buffer GL，涡旋振荡混匀，再加入200L 无水冰乙醇，涡旋混匀。将中所得的全部溶液转移到 Spin Column DM 中（Spin Column D