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1、1川芎嗪对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用【摘要】 目的 观察川芎嗪对谷氨酸损伤海马神经元的保护作用。方法 原代培养大鼠海马神经元，培养基中加入 1mmol/L 的盐酸川芎嗪溶液共同孵育 12h 后，加入 1mmol/L 谷氨酸损伤海马神经元20min。采用 MTT 法检测细胞活性; 测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH )活力的变化;细胞免疫组化检测各组细胞表达 AchE。 结果 川芎嗪可提高谷氨酸损伤后海马神经元的存活率，抑制因谷氨酸损伤引起的细胞内 LDH 的释放，可促进谷氨酸损伤细胞中 AChE 的表达。 结论 川芎嗪对谷氨酸诱导海马神经元损伤有保护作用。 【关键词】 川芎嗪;谷氨酸;海马神经
2、元: Objective To observe the protective effects of ligustrazine on glutamateinduced injury in cultured hippocampal neurons. Methods Primarily cultured hippocampal neurons from fetal rats were incubated with ligustrazine (1mmol/L) for 12 hours, then glutamate (1mmol/L) was added for 20 minutes to indu
3、ce injury. Cell viability was detected by MTT assay, and the change in LDH activity was determined by biochemical method. Finally, the expression of AchE in the cultured neurons was assayed by immuocytochemistry. 2Results Ligustrazine improved the survival rate of hippocampal neurons injured by glut
4、amate, inhibited the release of LDH from the kytoplasm injured by glutamate. The expression of AchE in the injured neurons was promoted by pretreatment of ligustrazine. Conclusion Ligustrazine can significantly exert protective effects on the hippocampal neuron injury induced by glutamate.KEY WORDS:
5、 ligustrazine; glutamate; hippocampal neuron海马是边缘系统的重要组成部分，参与学习、记忆、情绪反应及植物神经功能等。原代培养的海马神经元对许多致病因素和化学损害较为敏感，是研究神经元损伤及抗损伤的理想模型。在脑缺血模型中，海马神经元的损伤较为严重，其中兴奋性氨基酸含量增高是海马神经元损伤的原因之一。谷氨酸(glutamate, Glu)是哺乳动物脑内主要的兴奋性氨基酸，参与中枢神经系统的信息传递。但Glu 过度释放可产生神经兴奋性毒性，引起神经细胞损伤或死亡。川芎嗪(ligustrazine, Lig)是从中药川芎总生物碱中分离得到的一种有效活性生物
6、碱。Lig 能通过血脑屏障进入中枢神经系统，在脑中快速达到峰值，并持久地存留在大脑内。临床上常用 Lig 治疗脑缺血，其机制是通过扩张微血管改善微循环，抑制血栓形成，阻断自3由基连锁反应，降低细胞内钙离子超载，拮抗氨基酸毒性等途径来实现，具有多靶点、多层次、多环节的脑保护作用1。本研究采用体外海马神经元原代培养，观察 Lig 对 Glu 损伤海马神经元的保护作用，探讨 Lig 对脑损伤神经元的保护机制。1 材料与方法1.1 材料 实验动物采用健康孕期 15d 孕鼠，由第四军医大学实验动物中心提供;盐酸 Lig 注射液为哈尔滨三联药业有限公司生产; 四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜(DMSO)
7、 、L 多聚赖氨酸、阿糖胞苷为美国 Sigma 公司产品;胰蛋白酶、DMEM 培养基为美国Gibco 公司产品;胎牛血清为杭州四季青有限公司产品 ;6 孔板/96孔板为丹麦 Costar 公司产品 ;乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;其他试剂均为国产分析纯。Olympus 倒置相差显微镜(日本) ，CO2 培养箱(NAPCO 公司 )，酶联免疫检测仪(美国 BIOTek 公司)，兔抗大鼠 AchE 抗体(11000)、羊抗兔IgG(1200)、ABC 及 DAB 显色试剂盒( 美国 VECTOR 公司)。1.2 海马神经元的原代培养2 健康孕 15d 的 SD 大鼠，
8、麻醉后无菌条件下取胎鼠脑，解剖显微镜下取出的双侧海马，去除脑膜和血管，2.5g/L 胰酶 37消化 10min，用完全培养基(90% DMEM+10% FBS)终止消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度接种4于多聚赖氨酸包被的 24 孔/96 孔细胞培养板，置于 50mL/L CO2、饱和湿度、37培养箱中培养。12h 后加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的过度增殖，以后每周换液 2 次，每次换 1/2 培养液。培养至神经元分化完全后进行实验。1.3 海马神经元 Glu 损伤模型的建立及分组3 海马神经元按上法培养 7d 后，去除原来培养基，用 Lockes 液(154mmol/L NaCl、5.6mmol
9、/L KCl、 3.6mmol/L NaHCO3、2.3mmol/L CaCl2、5.6mmol/L Glucose、5mmol/L HEPES，pH 7.4)洗涤细胞 3 次，每次 5min。谷氨酸损伤组，以 Lockes 液配制1mmol/L Glu 2022作用于培养细胞 20min，撤除 Glu，用Lockes 液洗涤细胞 3 次，每次 5min，重新加入原培养基继续培养 12h。实验组用 Lockes 液含有 1mmol/L Lig 加入细胞中培养12h 后，再加入 Glu 作用 20min。对照组 Lockes 液无 Glu 和Lig。1.4 免疫细胞化学染色 海马神经元按上法培养
10、 7d 后，除去培养液，用 0.01mol/L PBS 洗涤一次，加入 40g/L 多聚甲醛，室温下固定 1h，去除固定液，用 0.01mol/L PBS 室温下洗涤 10min，共 3 次。用含 50mL/L 羊血清、含 1mL/L Triton X100 的 PBS 液在 37条件下封闭 30min，去除封闭液。滴加一抗(rabbit antiACh monoclonal antibody，11000)，4 放置过夜，PBS5洗。滴加二抗(goat antirabbit IgG, 1200 )，室温放置2h，PBS 洗。实验中设不加一抗的空白对照组，除以 PBS 代替一抗外，其余步骤同上。
11、DAB 显色，显微镜下观察免疫细胞化学染色结果。用 Image Pro Plus 6.0 图像分析软件行细胞灰度值检测，每张爬片随机取 5 个视野，每个视野随机取 10 个细胞，取其平均值。1.5 MTT 法检测海马神经元的活性 各实验组每孔加 10L MTT(5g/L)放入 37、50mL/L CO2 培养箱中培养 4h。然后每孔加人 100L 浓度为 200mg/L SDS，继续培养 12h，用酶联免疫检测仪测定 570nm 的吸光度。每个实验组设 8 个复孔，实验重复 3次。吸光度比值代表细胞活力。以空白对照组作为参照，其细胞生长率为 100%。各组生长率 =(各组吸光度值 /空白对照组
12、吸光度值)100%。1.6 乳酸脱氢酶(LDH)活性的测定 收集培养基上清液，剩余培养液-20 冰箱冻存 7h 之后，解冻，按试剂盒说明分别测定原上清液 LDH 的活性和培养板中剩余培养液冻溶后的 LDH 活性，计算LDH 漏出率。LDH 漏出率(%)= 上清液 LDH 活性/(冻溶后细胞培养液 LDH活性+上清液 LDH 活性)100%61.7 统计学处理 实验数据应用 Graph Pad Prism 5.0 统计软件分析。数据以均数标准差(s)表示，显著性检验采用单因素方差分析。以 P0.05 作为具有统计学意义。2 结 果2.1 海马神经元的培养 相差显微镜下观察发现，体外培养2h 大部
13、分细胞己经贴壁生长，此时可见少数神经元伸出 12 个突起。培养至 2d 突起增多，但神经元突起的联络较少。培养 7d 时，神经元胞体呈椭圆形或三角形，胞体周围光晕明显，反光均匀一致，立体感强，神经元突起的主干和分支明显延长、增粗，相互联系增多(图 1)。2.2 1mmol/L Lig 对 Glu 诱导海马神经元保护作用的形态学变化 Glu 作用于细胞 20min，继续培养 12h 后显微镜下观察，发现部分细胞变圆，胞体肿胀，细胞失去原有形态，突起淡化、减少或消失。细胞内、外出现较多的黑色颗粒，贴壁不牢，折光性下降(图 2)。 Lig 保护组与 Glu 损伤组相比，神经元的胞体较完整，大部分细胞
14、的存在少量的突起。细胞突起存在少量的联系，突起的数量较正常组减少。2.3 AChE 免疫细胞化学染色结果 镜下可见棕色颗粒为阳性反应物，免疫组化阴性对照组未见此棕色颗粒。阳性神经元呈现三7角形、椭圆形或圆形，突起明显。阳性反应物主要分布在细胞胞浆中，细胞核及突起着色较淡。与正常对照组和 Lig 保护组相比较，Glu 损伤组细胞明显浅淡(图 3)。对免疫组化结果进行半定量分析，结果发现正常组细胞的平均灰度值为 148.69.88，Glu 损伤组细胞的平均灰度值为 171.56.87，Lig 保护组平均灰度值为151.012.37。统计分析结果表明正常组灰度值低于 Glu 损伤组(P0.01)，L
15、ig 保护组灰度值低于 Glu 损伤组(P0.05)，正常组和保护组之间无统计学差异(表 1)。表 1 Lig 对 Glu 损伤培养海马神经元的保护作用2.4 Lig 对 Glu 损伤的海马神经元活性和 LDH 的影响 MTT法检测各组海马神经元活性(表 1)。结果显示，与对照组相比，Glu损伤后细胞活性显著下降(P0.001); Lig 保护组与 Glu 损伤组相比细胞活性明显升高(P0.05)。Glu 损伤后 12h，分别检测各孔培养上清中 LDH 的活力(表 1)。结果显示 Glu 损伤可导致海马神经元 LDH 释放显著增加，表现为培养上清 LDH 活力显著增加(P0.01)，1mmol
16、/L 的 Lig 可显著抑制 Glu 损伤神经元 LDH 的释放(P0.05)。3 讨 论Lig 是中药川芎的有效成分，在治疗缺血性脑血管病等方面8疗效肯定，而且对中枢神经系统损伤有较好的修复作用。研究表明Lig 可明显抑制皮质和海马 NOS 阳性细胞增多，与 NOS 拮抗剂LNAME(10mg/kg)的作用相似; 脑缺血时使用盐酸 Lig 注射液可显著降低细胞外兴奋性氨基酸神经递质 Glu 和天冬氨酸(Asp)的浓度4。Glu 是哺乳动物脑内含量最高的兴奋性氨基酸之一。许多中枢神经系统疾病可引起 Glu 的过度释放,从而产生严重的神经兴奋毒性，引起神经元损伤或死亡。海马是脑内对缺血、缺氧最为敏感的部位之一。与皮层神经元相比，海马神经元易纯化而且含有高密度的 Glu受体5。原代培养细胞比细胞株更接近生理状态的生物学特性，选用其探讨药物的作用机制具有实际意义。因此，本研究选用原代培养大鼠海马神经元，
