《炎性衰老机制与干预的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《炎性衰老机制与干预的实验研究（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、摘要】 目的 运用基因芯片筛选与炎性衰老相关的炎性细胞因子与受体特征基因，探讨其炎性细胞因子网络调控机制;观察淫羊藿总黄酮(EF)和淫羊藿苷(Ica)对该网络的干预效果与机制。方法 SD 大鼠分为 4 月龄(4 m)、24 m、24 m+EF 和 24 m+Ica 组，每组 10 只。分别取各组大鼠海马和肺组织，用炎症细胞因子与受体基因芯片对各组组织分别进行基因表达检测。结果 (1)海马组织：24 m 组与 4 m 组比较，促炎症细胞因子表达上调 ;同时抗炎症细胞因子下调。24 m+EF 组、 24 m+Ica 组与 24 m 组比较，可见大量抗炎症细胞因子上调而促炎症细胞因子下调。(2)肺组
2、织：24 m 组与 4 m 组比较，促炎症细胞因子上调，同时抗炎症细胞因子下调。24 m+EF 组、24 m+Ica 组与 24 m 组比较，发现大量抗炎症细胞因子上调而促炎症细胞因子下调。结论 老年大鼠存在促炎性细胞因子基因表达上调和抗炎性因子表达下调，导致促 抗炎性细胞因子网络平衡失调;EF 和 Ica 可能通过下调促炎性细胞因子基因表达和上调抗炎性细胞因子基因表达，重塑促 抗炎性细胞因子网络平衡而干预炎性衰老。 【关键词】 炎性衰老;基因芯片 ;大鼠;炎症细胞因子与受体;淫羊藿总黄酮;淫羊藿苷Study on the mechanism and intervention of infla
3、mm aging in ratsXIA Shi Jin, SHEN Zi Yin, YU Zhuo Wei, et al.Huadong Hospital Affiliated to Shanghai Fudan University, Shanghai 200040, China【Abstract】 Objective To study the mechanisms of inflammatory cytokines network regulation in the development of inflamm aging rats and analyze the Epimedium to
4、tal flavonoids(EF) and Icariin(Ica) intervention outcome. Methods Healthy male Sprague Dawley rats were divided into 4 months (4 m), 24 m, EF+24 m (24 m rats treated with EF) and Ica+24 m groups (24 m rats treated with Ica), each with 10 rats. The genes expressions of hippocampus and lung tissues fr
5、om the rats in each group were analyzed by inflammatory cytokines and receptors cDNA microarray respectively. Results (1)In rat hippocampus tissues, compared with those in 4 m group, pro inflammarory genes were up regulated and anti inflammatory genes were down regulated. After treated by EF or Ica,
6、 anti inflammatory genes were up regulated while pro inflammarory gene were down regulated in 24 m group. (2)In rat lung tissues, compared with those in 4 m group, 24 m rats showed up regulation of pro inflaming genes, while anti inflammatory genes were down regulated. Similar results were observed
7、after intervention by EF and Ica. Conclusions Up regulation of pro inflamatory cytokines or receptors together down regulation of anti inflamatory genes may eventually contribute to disequilibrium of the network of pro and anti inflammatory cytokines and receptors and high inflammatory state. EF and
8、 Ica may interfere in inflamm aging through rebuilding the new equilibrium of the network of pro and anti inflammatory cytokines and receptors.【Key words】 Inflamm aging;cDNA microarray; Rat; Inflammatory cytokins and receptors; Epimedium total flavonoids; Icariin自然衰老进程中有一个显著特征是慢性、低度、微炎性反应状态随增龄进行性升高，
9、Franceschi 等1在 2000 年首次将这种现象命名为炎性衰老 (inflamm aging)，被视为机体衰老进程速率和寿命的一个决定因素2 ，与老年相关疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、动脉粥样硬化和心脏病等密切相关3 。炎性衰老是衰老研究领域的一个新成员，炎性衰老的机制与干预策略正逐渐受到人们的关注4 ，但在我国还是空白。 本研究以炎症细胞因子网络为切入点，应用炎症细胞因子与受体基因芯片技术，以老年大鼠的海马和肺组织为对象，绘制基因表达谱，筛选炎性衰老相关基因，同时探讨淫羊藿总黄酮(EF)和淫羊藿苷(Ica)对其影响，对探讨炎性衰老的机制和干预策略具有重要的理论价值和潜在的应用前景。1
10、 材料与方法1.1 芯片及主要仪器 大鼠 Oligo GEArrayR炎症细胞因子与受体基因芯片(Inflammatory Cytokines and Receptors Microarray)(112 个基因，SuperArray，ORN 011)，购自上海康成生物有限公司。扫描仪(GeneChip Scanner 1000);图像数据分析软件：GEArray Expression Analysis Suite Software。1.2 主要药物 EF 由第二军医大学天然药化研究所从辽宁产朝鲜淫羊藿中提取，纯度大于 80%。Ica 购于上海友思生物技术有限公司( 纯度为 98%)。1.3 动
11、物与分组 清洁级健康雄性 SD 大鼠，购于四川省医学科学院实验动物中心，设4 月龄(4 m)、24 月龄(24 m)、24 月龄+EF(24 m+EF)和 24 月龄+Ica(24 m+Ica)组，每组 10只。24 m+EF 组予 EF(按 60 mgkg-1d-1，融于 5 ml 蒸馏水中) 灌胃，24 m+Ica 组予Ica(按 5 mgkg-1d-1，融于 2 ml 蒸馏水中)灌胃，24 m 组给予 2 ml 蒸馏水灌胃，均自 21个月满开始连续 90 d，余同常规喂养。1.4 取材 各组大鼠 3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，2%碘酒、75%酒精消毒，打开头颅和胸腔，迅速取出海马和肺组织
12、，所取组织立即放入液氮中，后转入-70冰箱保存待测。1.5 基因芯片实验 分别将每组 10 只大鼠组织样本总 RNA 等量混合后进行基因表达谱检测。组织块用 Trizol 氯仿 异丙醇法提取组织总 RNA,紫外分光光度计定量;用SuperScript和双链 cDNA 合成试剂盒合成和纯化 cDNA,用 RneasyMini 试剂盒用于体外转录合成 cRNA 以及 cRNA 的纯化及片段化。组织 mRNA，分别用 cy 3、cy 5 逆转录荧光标记制作 cDNA 探针。每组取 cRNA 片段 1.5 g 混合 ,共 15 g 配制杂交液,99温浴 5 min，12 000 r/ min 离心 5
13、 min，将 GEAhyb 杂交液(GEAhyb Hybridization Solution，SuperArray Bioscience)注入装有 Oligo GEArrayR芯片杂交管中，10 r/ min 60预杂交芯片 60120 min，45 ,60 r/ min 杂交芯片 16 h 。取出芯片,去除杂交液,加入 300 l 漂洗缓冲液直至芯片舱充满,应用 Fluidics Station 450 系统对芯片进行洗脱和染色。芯片图像可通过 X 胶片和 GeneChip Scanner 1000 扫描仪获得，获取基因表达的荧光信号强度值，用内参照基因(管家基因 )原始获取信号进行均衡和
14、修正。使用 GEArray 表达分析配套软件进行完整的芯片数据分析。计算荧光信号的强度和比值。基因差异表达相差 2 倍以上，即表达上调信号比的对数值(Signal Log Ratio，SLR)2 ，表达下调(SLR 2)为有统计学意义。基因检测在上海康成生物有限公司完成。2 结 果2.1 大鼠海马组织炎症细胞因子与受体基因差异表达2.1.1 24 m 组海马组织中表达上调或下调的炎症细胞因子及受体基因 与 4 m 组比较，24 m 组中表达上调的促炎性反应细胞因子与受体基因 9 个，即白介素(IL 12、1、2、6、8r )、肿瘤坏死因子(TNF 、TNFSF11)、趋化因子(CCL2、CX3
15、CL1)。表达下调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL 10r、13、4r、9r ，转化生长因子(TGF 、1)共 6 个。2.1.2 24 m+EF 组海马组织中表达上调或下调的炎症细胞因子与受体基因 与 24 m 组比较，24 m+EF 组中表达上调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL 10、10r 、13、9r，TGF 、1、2、R2 共 8 个;下调的促炎细胞因子与受体基因有：IL 15、18、1、2、6、6r、8r ，TNF，CCL2 、CCL3、CX3CL1 共 11 个。2.1.3 24 m+Ica 组海马组织中表达上调或下调的炎症细胞因子与受体基因 与 24 m 组比较，24 m+Ic
16、a 组中表达上调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL 10、13、4r、9r，TGF 1、2 共 6 个; 下调的促炎细胞因子与受体基因有： IL 15、1、2、6、8r ，TNF，CCL2、CCL3、CX3CL1 共 9 个。2.2 大鼠肺组织炎症细胞因子与受体基因差异表达2.2.1 24 m 组肺组织中表达上调或下调的炎症细胞因子及受体基因 与 4 m 组比较，24 m 组中表达上调的促炎性反应细胞因子与受体基因 14 个，即白介素(IL 12、12、15、18、1、1、2、3、6) 、肿瘤坏死因子(TNF、TNFSF11)、趋化因子(CCL2、CCL3、CX3CL1)。表达下调的抗炎细胞因子与受体基因有：IL 10r、13、4r、9r，TGF 、1 共 6 个。2.2.2 24 m+EF 组肺组织中表达上调或下调的炎症细胞因子与受体基因
