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1、1大鼠 IgE 依赖组胺释放因子基因的克隆表达及其功能研究作者：陈晓湘, 胡旭初, 徐劲, 郑南才, 余新炳【摘要 】 目的: 获得原核表达的可溶性大鼠 IgE 依赖组胺释放因子（rHRF）, 并检测其诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能。方法: 克隆 Wistar 大鼠 rHRF 基因完整编码区序列并在 BL21 细胞中进行原核表达, 纯化的可溶性重组 rHRF 刺激卵清蛋白变应原致敏的大鼠肺肥大细胞, 利用荧光分光光度法测定组胺释放量。结果: 测序证实克隆基因与 GenBank 中大鼠 IgE 依赖组胺释放因子（又称翻译控制肿瘤蛋白）mRNA 序列的一致性为 97%, 推测的氨基酸序列一致性
2、为 95%。SDSPAGE 显示重组 rHRF 相对分子质量（Mr ）约为 24000; 重组 rHRF 诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺不依赖变应原, 且呈剂量依赖关系。 结论: rHRF 具有不依赖变应原诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能, 可能在型超敏反应过程中发挥重要作用, 为进一步研究 rHRF 的免疫学功能打下基础。 【关键词】 大鼠 IgE 依赖组胺释放因子 基因克隆 原核表达 肥大细胞 组胺Abstract AIM: To clone and express the gene 2encoding rat IgEdependent histaminereleasing factor
3、(rHRF) and to study the effect of recombinant rHRF to induce histamine release from rat sensitized mast cells. METHODS: The complete coding region of rHRF was cloned and expressed in BL21 cells. The soluble recombinant rHRF was purified. Aliquots of the mast cells obtained from the lungs of OVAimmun
4、ized rats were separately stimulated by recombinant rHRF at different concentration. The released histamine was measured by the OPT spectrofluorometric procedure. RESULTS: The cloned DNA fragment showed 97% nucleotide sequence identity and 95% deduced amino acid sequence identity with the mRNA of ra
5、t IgEdependent histaminereleasing factor (or translationally controlled tumor protein) in GenBank. The recombinant rHRF showed a Mr of 24 000 in SDSPAGE. The purified rHRF which was independent of the allergen induced histamine releasing from the sensitized mast cells in a dosedependent manner. CONC
6、LUSION: The recombinant rHRF, which showed the effect of inducing histamine release from sensitized mast cells, would play an important role in the allergen diseases.Keywordsrat; IgEdependent histaminereleasing 3factor; gene cloning; prokaryotic expression; mast cell; histamine组胺释放因子是一大类具有促进肥大细胞和嗜碱性
7、粒细胞释放组胺等介质的生物活性物质的总称。根据发挥作用时对 IgE 依赖与否, 可分为 IgE 非依赖性和 IgE 依赖性两类。1995 年MacDonald 等1从人巨噬细胞系 U937 培养上清中鉴定出一种IgE 依赖组胺释放因子, 并证实其与人的翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein, TCTP）为同一蛋白, 与小鼠 TCTP 氨基酸序列具有 94%同源性。 IgE 依赖组胺释放因子可促进嗜碱性粒细胞释放组胺、 IL4、 IL132; 促进 B 细胞增殖和分泌免疫球蛋白3; 促进嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞释放IL84, 5,
8、同时发挥嗜酸性粒细胞趋化因子作用4, 引起局部炎症细胞聚集。因此认为该蛋白在型变态反应过程中发挥重要调节作用。肥大细胞是型超敏反应的关键效应细胞, 激活后释放组胺等多种介质。关于 IgE 依赖组胺释放因子对肥大细胞的作用未见报道。本研究旨在获得大鼠 IgE 依赖组胺释放因子（rat IgEdependent histaminereleasing factor, rHRF）重组蛋白 , 观察其诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能, 为以大鼠为模型进一步探讨 IgE 依赖组胺释放因子在型超敏反应发生过程中的作用奠定基础。1 材料和方法41.1 材料 Wistar 大鼠购自中山大学实验动物中心; 原核
9、表达载体 pET30a 及大肠杆菌菌株 DH5、 JM109、 BL21（DE3）由本实验室保存; 核酸电泳 Mr 标准、 蛋白质电泳 Mr 标准、 限制性内切酶 Nde I 和 Xho I、 T4 DNA 连接酶、 Ex Taq DNA 聚合酶、 dNTP 及 PMD19T simple vector 试剂盒购自大连宝生物工程有限公司; DNA 凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自北京赛百胜公司; TRIzol、 型胶原酶为 Invitrogen 公司产品; AMV 逆转录酶为 Promega 公司产品 ; HisTag 融合蛋白亲和纯化试剂盒为Novegen 公司产品; 卵清蛋白（级） 、
10、透明质酸酶、 组胺标准品为 Sigma 公司产品; 氢氧化铝佐剂为武汉中博生化有限公司产品; 邻苯二甲醛（OPT）为上海国药集团化学试剂有限公司产品; 引物设计由上海英骏生物技术有限公司合成。1.2 方法1.2.1 大鼠肝组织总 RNA 的提取 无菌操作取大鼠肝组织, 总 RNA 提取按照 TRIzol 试剂说明书步骤进行。1.2.2 逆转录聚合酶链式反应 以大鼠肝组织总 RNA 为模板进行逆转录, 反应体系 20 L, 反应条件为 37 45 min, 95变性5 min; PCR 反应体系 50 L, 反应程序为 95预变性 5 min 后, 开5始以下循环: 95变性 45 s, 54退
11、火 45 s, 72延伸 45 s, 共 32个循环, 最后 72延伸 10 min。扩增产物经 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测。1.2.3 TA 克隆 按照 PMD19T simple vector 试剂盒说明书操作, 将 RTPCR 扩增产物纯化回收后与 PMD19T simple vector 连接, 转化大肠杆菌 JM109, 在涂布有 Xgal 和 IPTG、 且Amp+的 LB 平板中挑取白色的阳性重组克隆, 经 PCR、 双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司测序, 并与 GenBank 中大鼠 IgE依赖组胺释放因子（又称 TCTP）mRNA 序列进行同源性分析。上游引物:
12、5GAA CAT ATG ATC ATC TAC CGG GAC3, 下游引物: 5GCG CTC GAG ACA TTT TTC CAT CT3, 分别带有 Nde I 和Xho I 酶切位点。1.2.4 表达载体的构建 将以重组 PMD19T simple vector为模板进行 PCR 得到的扩增产物和空载体 pET30a 用限制性内切酶 Nde I、 Xho I 进行双酶切, 纯化回收后连接, 转化大肠杆菌DH5, 挑取阳性克隆扩增后提取重组质粒进行 PCR、 双酶切和测序鉴定。1.2.5 重组蛋白的表达 将重组质粒 pET30arHRF 转化BL21（DE3）, 挑取阳性克隆接种于含
13、卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的6LB 液体培养液中, 37振荡培养过夜, 再按 1%转接至新鲜 LB 液体培养基中（Kan+）, 37振荡培养 2 h, 加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L, 诱导表达 5 h, 4 离心收集菌体, 冰浴下超声破碎, 离心后取上清通过 HisTag 融合蛋白亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白。SDSPAGE 分析表达产物的 Mr。1.2.6 动物致敏 雄性 Wistar 大鼠, 200 g 左右, 实验开始时腹部皮下分 3 点注射 0.5 mL 卵清蛋白及氢氧化铝混合液(含卵清蛋白 1 mg、 氢氧化铝 200 mg), 同时腹腔注射上述混合液 0.5
14、 mL。免疫后 14 d, 氯胺酮（5 mg/kg）麻醉, 无菌操作取肺。1.2.7 组织消化与细胞分离 将新鲜切除的肺组织经DMEM（含 20 mL/L 胎牛血清, 1104U/L 青霉素, 100 mg/L 链霉素）冲洗后, 用剪刀在上述溶液中细细剪碎。组织块用上述 DMEM液洗涤 3 次（1500 r/min, 37, 5 min）后, 将其与型胶原酶(1.5 g/L DMEM, 10 mL DMEM/g 肺组织)、 透明质酸酶( 用量为型胶原酶的一半)、 20 mL/L 胎牛血清及青霉素（1104 U/L） 、 链霉素（100 mg/L）混合, 在 37 培养箱中消化 60 min,
15、并不时摇动。用孔径为 100 m 的筛网将细胞与未消化的残留组织碎片分离开6。经 3 次洗涤（条件如前）后, 将细胞悬浮于含 100 mL/L胎牛血清、 1104 U/L 青霉素, 100 mg/L 链霉素的 DMEM 中, 37培养约 16 h。71.2.8 不同浓度 rHRF 的准备 将纯化得到的重组 rHRF 用完全 HBSS（含 1.8 mmol/L Ca2+、 0.5 mmol/L Mg2+）透析, 重组 rHRF 经稀释, 得到浓度梯度为 20、 100、 200、 300 及 400 mg/L 的溶液。每个浓度梯度各取 0.5 mL 加入离心管, 只含 0.5 mL完全 HBSS
16、 的离心管则作为自发性和全部组胺释放的对照管, 操作完毕后置于 4。1.2.9 致敏肥大细胞的激活 取 10 L 细胞悬液用等量台盼蓝染液染色 3 min 后, 用血细胞计数器在显微镜下计数, 计算活细胞百分比; 取 10 L 细胞悬液用等量甲苯胺蓝染液染色 10 min 后, 用相同方法计数, 计算肥大细胞数占细胞总数的百分比。将细胞用含20 mL/L 小牛血清的不全 HBSS（不含 Ca2+、 Mg2+）和完全HBSS 依次洗涤 1 次后, 重悬于完全 HBSS 中, 并调整细胞密度为2510650106 个肥大细胞/L。立即将细胞悬液加入预温至37的装有不同浓度 rHRF 的离心管及对照管中 , 每管 0.5 mL。轻轻混匀后开始计时, 37 35 min 后将离心管置冰浴终止反应, 并立即于 4离心（20
