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1、1仙灵骨葆对兔膝骨性关节炎治疗作用的研究作者：程潭，张柳，李震，李强，穆树林，田发明，刘永强【摘要 】 目的 研究仙灵骨葆(xianlinggubao, XLGB)对兔骨性关节炎关节软骨及软骨下骨的保护作用。方法30 只 3 个月龄雄性日本大耳白兔，随机分为对照组(Sham)、盐水组 (ACLT+NS)和仙灵骨葆组(ACLT+XLGB)，每组各 10 只。盐水组和仙灵骨葆组行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction, ACLT)造成膝骨性关节炎模型。术后仙灵骨葆组 125 mg/(kgd)灌胃; 盐水组则给予等剂量生理盐水。6 周后
2、处死动物，取股骨测量骨密度，之后脱钙制片，行 HE 染色、Mankin 评分及 BMP-2、MMP-13 免疫组化染色 ;取右膝胫骨近端包埋，制成硬组织切片，用于骨组织形态计量学测量。结果(1)Mankin 评分：仙灵骨葆组显著低于盐水组。(2)股骨远端骨密度及胫骨近端软骨下骨骨量：仙灵骨葆组均显著高于盐水组。(3)免疫组化：仙灵骨葆组 MMP-13的表达显著低于盐水组，BMP-2 的表达显著高于盐水组。 结论仙灵骨葆 125 mg/(kgd)灌胃能够部分阻止骨关节炎兔关节软骨的退变，其作用机制可能与下调 MMP-13 的表达，上调 BMP-2 的表达，同时增加软骨下骨骨量，改善其微观结构有关
3、。 【关键词】 仙灵骨葆; 骨性关节炎; 软骨细胞; 软骨下骨; BMP-2; 2MMP-13Abstract: ObjectiveTo assess the protective effects of Xianlinggubao on articular cartilage and subchondral bone in experimental osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transaction (ACLT)in rabbits. MethodsThirty healthy Japanese white rabb
4、its were divided randomly into three groups: sham group, ACLT+XLGB group and ACLT+ NS group. Rabbits in ACLT+XLGB group and ACLT+NS group received anterior cruciate ligament transection(ACLT)on the right knee. Rabbits in sham group received untreatment as control. ACLT+XLGB group received a daily ad
5、ministration of XLGB at a dose of 125 mg/kg of body weight for 6 weeks.In contrast, ACLT+NS group received saline at the same dose. All rabbits were sacrificed at 6 weeks after operation. The right femora were removed, measured for bone mineral density (BMD), and then were observed for the macro-pat
6、hologic changes with HE staining and graded by Mankins scale. Expression levels of BMP-2 and MMP-13 were detected by immunostaining. The subchondral bone of right tibial plateau was cut and stained for the measurement of bone histomorphometry.Results(1)The Mankins score 3in ACLT+ XLGB group was sign
7、ificantly lower than that in ACLT+ NS group (P0.05). (2) The BMD of distal femora and subchondral bone mass of proximal tibia in ACLT+ XLGB group was significantly higher than that in ACLT+NS group (P0.05). (3) In ACLT+XLGB group:the expression level of MMP-13 was significantly lower while BMP-2 was
8、 significantly higher than that in ACLT+NS group (P0.05).ConclusionDaily administration of XLGB at a dose of 125 ug/kg/d for 6 weeks can partially decrease the expression level of MMP-13 and increase the expression level of BMP-2.XLBG probably protects articular cartilage by improving the structure
9、of subchondral bone and reducing the degradation of cartilage matrix.Key words：xianlinggubao; osteoarthritis; chondrocyte; subchondral bone; BMP-2; MMP-13骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节疼痛、晨僵及功能损伤造成的活动受限为临床特征的慢性疾病。其病理学特点为降解代谢胜于合成代谢关节软骨的变性，表现为糜烂、溃疡和脱失、软骨下骨硬化和骨赘的形成。流行病学数据显示1在中老年人群中,骨关节炎是一种发病率较高的、非常普通的肌肉骨
10、骼疾病，但目前4还没有找到真正能够治愈的方法和药物1。研究发现24 ，仙灵骨葆(XLGB)对成骨细胞和破骨细胞都具有显著的调控作用，并能改善骨小梁三维结构5，可能存在对 OA 治疗的巨大潜力。本研究旨在观察仙灵骨葆对骨关节炎模型兔关节软骨的保护作用，同时检测软骨下骨量及骨关节炎发生促进因子 MMP-13 及骨关节炎发生保护因子 BMP-2 的表达，以期进一步探讨其可能的作用机制。1 材料与方法1.1 动物分组与处理健康 3 个月龄雌性日本大耳白兔 30 只(购自北京维通利华公司，批号：SCXK 京，2005-0002)。随机分为三组：对照组(Sham) 、盐水组(ACLT+NS)和仙灵骨葆组(
11、ACLT+XLGB)。盐水组和仙灵骨葆组行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction, ACLT)。造模术后，ACLT+XLGB 组行每日 1 次仙灵骨葆(贵州同济堂公司) 灌胃 125 mg/(kgd)，ACLT+NS 组给予等量生理盐水灌胃。Sham 组只打开右膝关节，不行前交叉韧带切断术,缝合膝关节。51.2 标本采集和处理三组实验动物于 6 周后处死并取材。将胫骨近端固定于 70%酒精，冠状面锯开胫骨，脱水固定，经甲基丙烯酸甲脂包埋，作 5 m 切片，Giemsa 染色。采用骨组织形态计量学方法测量软骨下骨骨小梁。股骨远端测量
12、骨密度，股骨髁置于 4%多聚甲醛中固定，15%EDTA-2Na 溶液脱钙，石蜡包埋，作 4 m 连续切片。行 HE染色、BMP-2 和 MMP-13 免疫组化染色。1.3 免疫组织化学 (SABC 法)4 m 连续切片，平铺于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，烤片 4 h，脱蜡至水。3%过氧化氢冲洗 10 min，PBS 冲洗 3 次5 min，复合酶 37修复 10 min。滴加抗兔 BMP-2 和 MMP-13 多克隆一抗抗体(购自武汉博士德) ，37湿盒孵育 2h。滴加生物素化二抗( 购自武汉博士德)，高敏过氧化物酶复合物，DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。1.4 观察指标HE
13、染色观察采用 Mankin 法评分，免疫组化切片观察染色情况，骨密度测量并记录三组标本股骨远端 1/3 骨密度和内(r1)外6(r2)侧髁软骨下骨(软骨下 0.20.6 cm 间)的骨密度。Giemsa 染色切片用 Leica DMLB2 荧光/光学显微镜及 Leica DC300 数码摄像系统进行观察与摄取图像;在 20 倍物镜下取软骨下骨板至骨骺上骨板间骨小梁为观察范围，每个切片随机选 3 个视野，测定骨组织形态计量学相关指标参数。1.5 统计学分析实验数据建立 Excel 数据库，采用 SPSS 12.5 统计软件进行单因素方差分析，两组间采用独立性“t”检验，以 x-s 表示，以P0.
14、05 表示差异有显著性。2 结果2.1 肉眼大体观察结果由于膝关节前交叉韧带被切断，关节结构不稳定造成关节炎病理改变，软骨关节面破溃，并形成骨赘，以代偿关节的不稳定。Sham 组膝关节面光滑完整，有光泽;ACLT+NS 组膝关节面完整性遭到破坏，呈现颗粒感，表面晦涩、无光泽，滑液混浊;ACLT+XLGB 组膝关节面较光滑完整，有光泽(图 1)。72.2 HE 染色细胞形态学观察结果HE 染色显示：Sham 组正常软骨基质染成粉红色，着色均匀，软骨细胞核呈深蓝色，胞浆呈粉红色，软骨细胞分 3 层，表层软骨细胞呈梭形，近似水平排列，中间层软骨细胞呈散在无序排列。柱状层软骨细胞呈柱状排列，其下方为潮
15、线。钙化软骨层的细胞较大，其下方是骨质及骨髓腔;ACLT+NS 组关节软骨表层可见单一软骨陷窝内有两个细胞核聚集，于软骨表层及中间层交界处，偶见大的、形态不规则的细胞，软骨细胞克隆增殖而呈巢状，细胞排列紊乱，软骨内细胞密度不均一，部分区域细胞密度增加或减少;ACLT+XLGB 组软骨基质着色较均匀，软骨细胞分层清晰有序，细胞形态较规则。ACLT+NS 组 Mankin 评分结果明显高于 Sham 组,表明本实验 OA 动物模型建立成功 ;ACLT+XLGB 组较 ACLT+NS 组，Mankin 评分结果明显降低, 有统计学意义(P 0.05)(见表 1)。表1 各组 Mankin 评分结果2
16、.3 免疫组化 BMP-2、MMP-13 染色切片结果MMP-13 免疫组化染色，关节软骨细胞阳性表达的胞浆和胞外基质被染成棕黄色。Sham 组胞浆和基质着色区域少，着色浅;ACLT+NS 组胞质和胞外基质着色区域广泛，着色深，箭头所示为阳性细胞表达;ACLT+XLGB 组胞浆和胞外基质着色范围较少，局限于软骨表层，阳性细胞较少且着色较浅，箭头所示为阳性细胞表达8(图 2)。BMP-2 免疫组化染色，关节软骨细胞阳性表达的胞浆和胞外基质染成棕黄色。Sham 组，阳性细胞胞浆和基质着色区域较少，着色浅，箭头所示为阳性细胞表达;ACLT+NS 组，胞质和胞外基质着色范围较少，局限于软骨表层且着色较浅;ACLT+XLGB 组，胞浆和胞外基质着色区域广泛，着色深，箭头所示为阳性细胞表达(图 3)。2.4 骨密度测量结果ACLT+XLGB 组较 ACLT+NS 组，股骨远端 dBMD(股骨远端 1/3 骨密度)骨密度升高，差别显著(P0
