《DXS8378基因座等位基因分型标准物的制备及其遗传多态性》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DXS8378基因座等位基因分型标准物的制备及其遗传多态性（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1DXS8378 基因座等位基因分型标准物的制备及其遗传多态性【摘要】 目的 采用分子克隆技术制备 X 染色体 DXS8378 位点等位基因分型标准物，了解该 STR 位点在中国云南傈僳、普米、德昂三个群体的遗传多态性及其法医学应用价值。方法 用 PCR 扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分离各等位基因片段，回收纯化后进行二次扩增，分别插入到 pGEMT Easy 质粒载体中，DNA 测序证实插入片段的大小和结构，等位基因片段按国际标准进行命名后，经转化、扩大培养、扩增及再鉴定后制备出该位点的等位基因分型标准物，进行群体遗传学研究。结果 得到 DXS8378 位点分型标准物，应用此分型标准物研
2、究中国云南傈僳、普米、德昂族人群中基因型分布频率。结论 该法制备的 STR 位点等位基因分型标准物适用于法医学鉴定实践,具有较高的应用价值，适合于群体遗传学的分析。 【关键词】 分型标准物 短串联重复序列 重组质粒 遗传多态性 DXS8378ABSTRACT: Objective To investigate the genetic polymorphism of DXS8378 STR locus of chromosome X in Chinese Lisu, Pumi and Deang populations in Yunnan and 2construct relative stan
3、dard allelic ladders. Methods After being amplified by PCR, different STR allelic fragments were isolated from the PAG electrophoresis. The STR allelic fragments were extracted by kit and reamplified by PCR to obtain purified allelic fragments. Next, the purified allelic fragments were subcloned ind
4、ividually into the PUC plasmid vectors, and the size and structure of the inserts were confirmed by the analysis of their DNA sequences. Then we transfected it into competent E.coli DH5TM cells, and finally, the recombinant plasmids DNA with the inserts were used as template for reamplification to g
5、enerate the standard ladders. Results The standard allelic ladder for DXS8378 locus was obtained, with which the genetic polymorphisms of DXS8378 locus in three Chinese populations in Yunnan were studied. Conclusion The standard ladder made by this method is excellent, and DXS8378 is powerful for fo
6、rensic practice in Chinese population.KEY WORDS: allelic ladder; short tandem repeat; recombined plasmid; genetic polymorphism; DXS8378人类 X 染色体由于其独特的遗传方式1，在 X 染色体连锁遗3传病的基因定位、遗传病的基因诊断和法医学的性别鉴定等多方面具有重要的价值。两个多态信息含量(polymorphism information content, PIC)相当的 STR 位点作比较时，X 染色体上的 STR 位点的平均排除率(mean exclusion
7、 chance, MEC)比常染色体上的位点要高的多。因此，在姐妹认定和女性的父权鉴定等法医学领域中，X染色体特异性的 STR 有重要的应用价值24 。用 PCR 扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析 STR 基因座时，分型是依据谱带的位置，而采用分子克隆技术制备大量优质的等位基因分型标准物，既可以提高分型的准确性，又可以增加实验结果间的可比性。目前，分型标准物主要依靠国外几家试剂大公司提供，其价格昂贵，对于新发现的 STR 位点，其分型标准物在市场上也无法购得。同时，一些在中国群体中识别机率和非父排除概率高的STR 位点的分型标准物不能提供56 。为此，我们应用分子克隆技术，在国内外首先制备出
8、DXS8378 位点的 STR 分型标准物。应用自制的分型标准物，首次调查了中国云南地区傈僳、普米7、德昂族群体中的 DXS8378 基因型分布频率，对其在法医学中的应用价值进行评价，对实现以此技术为基础的 STR 分型标准物的标准化、国产化进行了探索8。1 材料与方法41.1 样本与引物 遵循知情同意原则 ,随机抽取中国云南地区93 名普米族(其中女性 37 名)、95 名傈僳族(其中女性 38 名)和 83名德昂族(其中女性 38 名) 群体中无亲缘关系个体的静脉血,EDTA 抗凝，-20 保存。引物序列查自 GenBank，分别为 F：CAC AGG AGG TTT GAC CTG TT
9、；R：AAC TGA GAT GGT GCC ACT GA，由奥科公司合成。1.2 试剂与仪器 2Taq polymerase mix 和 DH5 感受态细胞(天为时代公司 )； pGEMT EasyVector System(美国Promega 公司) ；聚丙烯酰胺凝胶 DNA 回收试剂盒(Biospin 公司) ；EDTA 等其余试剂均为国产分析纯。台式高速离心机(德国 Hermle公司)；微量可调加样器(10、20、50、100、200、1000L)(法国Gilson 公司 )；三相恒压电泳仪 (美国 BiaRad 公司)；干热器(美国Bellco 公司)；旋涡混匀器(日本 Tomy k
10、ogyo 公司)；超净工作台(中国扬州医疗设备厂) ；低温冰箱(-30，-70)(日本 Sanyo 公司)；ABI3730 自动测序仪( 美国 ABI 公司)。1.3 制备标准分型物模板 DNA 通过 Chelex 法提取云南普米族、傈僳族和德昂族群体样本 DNA，PCR 扩增，反应体系：总体积 13L， 2Taq polymerase mix 6L，引物 1L(5nmol/L)，DNA 2L，H2O 2L。反应条件为：变性 94 30S， 退火 61 45S，延伸 72 60S，共 30 个循环。5用 60g/L 变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度 5%)电泳分离 PCR 扩增产物，银染显色。从群体
11、样本的扩增产物中，选出了 5 个不同大小片段长度的等位基因，用聚丙烯酰胺凝胶 DNA 回收试剂盒纯化各个片断，制备成 PCR 再扩增的模板。1.4 PCR 再扩增、产物鉴定与纯化 将制备好的 5 份 DNA 进行扩增，反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后再确定其片段大小，并进行纯化。1.5 PCR 产物的克隆 采用 pGEMT Easy Vector System克隆试剂盒，将纯化后的 PCR 片段直接插入质粒的多克隆位点。重组后的质粒转化 DH5 感受态细胞，选择培养筛选，再用以上的扩增方法选出含有正确插入片段的克隆。1.6 重组质粒的 DNA 测序 采用 ABI3730 全自动遗传
12、分析仪，以质粒公用的 M13 正反引物对重组质粒的插入片段进行双向循环测序，确定插入片段的大小及组成，以国际法庭血液遗传学学会(International Society of Forensic Haemogenetics, ISFH)推荐的命名原则进行各等位基因命名9。1.7 重组质粒的扩大培养与保存 对经测序证实的含有正确等6位基因插入片段的质粒扩大培养、纯化后，得到该基因座的等位基因分型标准参照物重组质粒。-20保存。1.8 等位基因分型标准物的制备和再鉴定 用含该基因座等位基因插入片段的重组质粒 DNA 为模板，进行 PCR 扩增，反应体系及条件如前。纯化各基因座各等位基因的 PCR
13、产物，混合制备成等位基因分型标准物阶梯，通过 60g/L 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色，验证所得标准分型物的可用性。1.9 数据分析 利用 SPSS12.0 统计学软件计算各基因座等位基因片段的频率和基因型频率。利用 2 检验进行HardyWeinberg 平衡吻合性检验。根据 100 名普米族、98 名傈僳族、83 名德昂族无关个体该基因座的等位基因和等位基因型，分别计算杂合度(heterozygosity, H)、个人识别率 (power of discrimination, PD)、多态信息量(polymorphism information content, PIC)。2 结果2.
14、1 重组质粒插入片段的序列分析及 DXS8378 的阶梯状分型标准物的制备 用 ABI3730 测序结果分析，得知 DXS8378 的 5个插入片段是以四核苷酸 CTAT 为核心序列重复 9-13 次，其长度7为 199-215bp，与 GenBank 中公布的数据完全一致。根据 ISFH规定的命名原则，插入片段的几个等位基因分别命名为 9-13。用分子克隆技术制备等位基因的阶梯状分型标准物(图 1)。2.2 分子克隆制备的 DXS8378 基因座分型标准物应用于群体研究的结果 将制备的 DXS8378 阶梯状分型标准物用于云南地区普米族、傈僳族、德昂族群体，分别检出 5 种等位基因以及 11
15、 种不同的基因型，等位基因频率分布范围为 0.132-0.649。基因型频率范围为 0.026-0.450，各基因座的具体遗传学和法医学信息见表1 至表 4。图 1 DXS8378 等位基因分型标准参照物的电泳分型结果（略）Fig.1 The electropherotyping results of DXS8378 allelic ladderM: the mixture of DXS8378 allelic ladder; M: DXS8378 allelic ladder; 1-5: the fragments amplified by recombinant plasmid; 1-5
16、the repeat structure (ctat) range from 9-13表 1 DXS8378 位点在傈僳族、普米族和德昂族人群中的基8因频率分布（略）Table 1 Distribution of allelic frequencies for DXS8378 locus in Chinese Lisu, Pumi and Deang populations in Yunnan表 2 DXS8378 基因座女性的基因型频率分布（略）Table 2 The distribution of genotypes for DXS8378 locus in Chinese Lisu, Pumi and Deang female populations in Yunnan表 3 女性基因型分布的 HardyWeiberg 平衡定律检验（略）Table 3 Test for HardyWeinberg equ
