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1、1CK19 mRNA 在大肠癌患者外周血中的表达及临床意义作者：赵红强 王前 安泽武 郑兴学 王鹏 陈治 齐洪峰 梁冲强 赵冠【摘要 】 目的探讨 CK19 mRNA 在大肠癌患者外周血的表达及临床意义。方法应用巢式 RT-PCR 技术检测 20 例健康人、20 例大肠腺瘤疾病患者和 90 例大肠癌患者外周血 CK19 mRNA 的表达。结果健康人中 CK19 mRNA 不表达，大肠良性腺瘤疾病患者外周血中 CK19 mRNA 有 1 例表达，表达率为 5%，大肠癌患者外周血中CK19 mRNA 有 53 例，表达率为 58.9%，CK19 mRNA 表达率与肿瘤分期，瘤细胞的分化程度，肿瘤转
2、移有显著相关性(均P0.05)。结论 CK19 mRNA 作为检测大肠癌患者外周血微转移的分子标记物具有良好的敏感度和特异性同时 CK19 mRNA 可作为判断大肠癌患者的预后的指标。 【关键词】 大肠癌;外周血;CK19;巢式 RT-PCR细胞角蛋白(CK) 来源于上皮组织，是真核细胞的细胞骨架中间丝蛋白，广泛表达于上皮组织细胞中，而在间叶组织中缺乏表达1 。CK19 是 CK 家族的重要成员之一，起源于上皮组织的大肠癌2保留着某些上皮组织特异性标记物的表达，而间叶组织中一般无上皮组织标记物表达2 。本研究采用巢式 RT-PCR 技术检测 CK19 mRNA 在大肠癌患者外周血中的表达与 D
3、ukes 分期、肿瘤细胞分化程度、血管生成、微转移和复发之间的关系。1 材料与方法1.1 研究对象随机选择 2006 年 4 月至 2007 年 2 月在我院普外科住院治疗的大肠癌患者 90 例，入选条件： 术前无放、化疗;术后病理证实为管状腺癌或乳头状腺癌。健康志愿者 20 例，大肠良性腺瘤患者 20 例。1.2 临床资料 90 例大肠癌患者，年龄在 3565 岁，中位年龄 53 岁，手术分期 Dukes 分期标准，其中 A 期 19 例，B 期 20 例，C 期 40 例，D 期 11 例,管状腺癌 50 例，乳头状腺癌 40 例，按分化程度分为高分化 13 例，中分化 57 例，低分化
4、20 例。1.3 引物设计参照 GenBank，利用 Primer Premier 5.0 引物设计软件进行引物设序列见表 1，由北京赛百盛公司合成。1.4 标本收集及总 RNA 提取抽取约 4 ml 新鲜血弃去前 2 ml以防抽血过程中上皮细胞污染，留取 2 ml 于 EDTA 抗凝管中，红3细胞裂解液裂解红细胞，分离有核细胞，采用 Trizol 试剂(Invitrogen 公司)抽提总 RNA。样本中加入 1 ml Trizol 试剂反复吹打使细胞裂解，加入 200 l 三氯甲烷剧烈震荡，冰上静置 25 min，120 000 r/min 离心 15 min，小心抽取上清放 EP 管中，加
5、入等体积的预冷异丙醇与-20静置 20 min，120 000 r/min 离心10 min，可见管底有白色沉淀即是 RNA，弃去上清加入无核酸酶75%乙醇洗涤 RNA 沉淀，充分晾干加入 DEPC 水溶解 RNA，所得的 RNA 溶液用 RNase-free DNaseI(Fermentas 公司)处理以去除可能存在的 DNA 基因组污染，-80冰箱保存。表 13 种目的基因的引物序列及产物大小1.5cDNA 合成及巢式 RT-PCR 扩增使用 cDNA 合成试剂盒(Fermentas 公司) 根据所测 RNA 浓度加入 2 g RNA 总反应体系为 20 l，按照说明完成 cDNA 第一链
6、，巢式 RT-PCR 扩增条件，第 1 轮：94 1 min,65。C50 s,72 2 min,72 40 s 循环 5 次;94 50 s,67 50 s,72 2 min,72 40 s,循环 25 次;72终延伸10 min。第 2 轮：9450 s,72 2 min,循环 30 次;72延伸 10 min。所用反应体系为 25l，使用 2TaqPCRMasterMix(天根公司)PCR 反应体系：cDNA 2.5 l，Primer(10mol/L)1,2 各 1 l，2Taq PCR Master Mix 12.5 l，DEPC 水 8 l。1.6 灵敏度测试使用大肠癌细胞株 A54
7、4，由中南大学湘雅医4学院提供，所测灵敏度可达 106。1.7 统计学方法使用 SPSS 11.5 统计软件进行 2 检验。2 结果2.1 总 RNA 鉴定实验中抽取 RNA，OD260/280 值在1.781.99 之间，于 1%琼脂糖凝胶中电泳分析 EB 染色，凝胶成像系统中成像可见 28 S,18 S 条带清晰可见，见图 1。2.2 巢式 RT-PCR 检测结果见图 2。图 1 部分总 RNA 标本的琼脂糖凝胶电泳图 2 部分患者外周血 CK19 巢式 RT-PCR 的检测2.3 健康人、大肠良性腺瘤患者和大肠癌患者外周血中 CK19 mRNA 的表达情况 20 例健康人外周血中无 CK
8、19 mRNA 表达，20例大肠良性腺瘤患者外周血中 1 例 CK19 mRNA 表达，表达率为5%，90 例大肠癌患者外周血中 53 例 CK19 mRNA 表达，表达率为 58.9%。大肠癌患者外周血中 CK19 mRNA 表达率明显高于健康人和大肠良性腺瘤患者(2=9.432，P0.05)。2.4CK19 mRNA 表达与大肠癌预后相关因素分析 90 例大肠癌患者中，(A+B) 期的 CK19 mRNA 表达率为 31.6%。(C+D)期为78.9%。(C+D)期患者外周血 CK19 mRNA 表达率明显高于(A+B)5期患者(2=9.022，P0.05)。高、中分化组的 CK19 mR
9、NA 表达率为 51.4%，低分化组为 85%，低分化组的 CK19 mRNA 表达率明显高于高、中分化组(2=8.232，P0.05)。3 讨论CK19 在肿瘤的发生和转移中发挥重要作用，将 CK19 作为肿瘤筛选的一种肿瘤特异性标记物基本已经基本确立3 ，其与肿瘤临床参数的研究已经成为热点。Saintigny 等4以CK19、CK7 及 MUC-1 mRNA 为指标用实时定量 RT-PCR 侦测大肠癌患者外周血认为 CK19 mRNA 在病患组有较高的表达，在健康志愿者外周血中低表达，并认为 CK19 mRNA 与大肠癌的发生有关。本研究表明，大肠癌患者外周血的阳性率要比健康志愿者和大肠良
10、性腺瘤患者明显高。本研究还发现，CK19 mRNA CD 期大肠癌患者外周血中的阳性率显高于 AB 期大肠癌患者，其以亦发现CK19mRNA 在低分化大肠癌患者外周血中的阳性率明显高于高和中分化大肠癌患者。理论上起源于上皮组织的大肠癌保留着某些上6皮组织特异性标记物的表达，而间叶组织中一般无上皮组织标记物表达2 。如果在大肠癌外周血中检测到上皮组织特异性标记物，即可诊断为转移。早在 1997 年，Oossterkamp 等5证明有不同数量的 CK19 mRNA 及蛋白被检测出，但是在非上皮来源的肿瘤细胞中的量比上皮来源的肿瘤中量要低得多。本研究发现，CK19 mRNA 在伴有转移灶的大肠癌患者
11、外周血中的阳性率明显高于只有原发灶的大肠癌患者。但 CK19 mRNA 在大肠癌患者病理类型之间的差异不具有统计学意义。综上所述，在大肠癌患者外周血中，CK19mRNA 表达上调，CK19mRNA 与大肠癌的生长和转移过程发挥着重要作用，CK19mRNA 的表达与大肠癌的恶性程度和分期有关，可能作为判断大肠癌预后的指标。【参考文献】1Kruger W，Zander AR.MUC1 expression in hemopoietic tissuesJ. Hematotheer Stem Cell Res，2000;9(4):409-10.2Iwao K，Watanabe T,Fujiwara Y
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13、.Clin Chem,1996;2(9):1369-81.4Saintigny P,Coulon S,Kambouchner M,et al.Real-time RT-PCR detection of CK19,CK7 and MUC-1 mRNA for diagnosis of lymph node micrometastases in colon carcinomaJ.Int J Cancer，2005;115(6):777-82.5Oosterkamp HM，Scheiner L，Stefanova MC，et al.Comparison of MUC-1 expression in epithelial and non-epithelial cancer cell lines and demonstration of a new short variant form(MUC-1/Z)J.Int J Cancer，1997;72(1):87-94.
