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1、1CEECL 法同时测定复方磷酸可待因中三种成分的方法学研究作者：李海燕，木合塔尔吐尔洪，唐玉海，张广彬【摘要 】 目的 建立毛细管电泳 电化学发光法分离并检测复方磷酸可待因中三种成分，磷酸可待因、马来酸溴苯那敏和盐酸麻黄碱含量的新方法。方法 基于碱性介质中，复方磷酸可待因溶液中三种主要成分对联吡啶钌在铂电极上的电化学发光信号的增敏作用，且增敏强度和药物浓度成线性关系，与毛细管电泳联用，建立了毛细管电泳 电化学发光法分离并检测其含量的新方法。结果 在优化的实验条件下，确定三种药物对照品的线性范围、线性方程和检出限。通过对浓度为 1.010-5kg/L 的磷酸可待因、马来酸溴苯那敏和盐酸麻黄碱对
2、照品进行 12 次平行测定，其 ECL 发光强度的 RSD值分别为 2.89%，3.76%，3.32%。结论 该方法可用于复方磷酸可待因口服溶液中三种主要成分的含量测定，待测样品中的基质不干扰测定，方法的回收率分别为 100.4%，101.9%，99.8%(n=5)。 【关键词】 毛细管电泳；电化学发光；磷酸可待因；马来酸溴苯那敏；盐酸麻黄碱ABSTRACT: Objective To establish a novel method for 2simultaneous determination of three ingredients (codeine phosphate, bromphe
3、niramine maleate and ephedrine hydrochloride) in compound codeine phosphate solution by using capillary electrophoresis (CE) coupled with electrochemiluminescence (ECL). Methods Based on enhanced ECL intensity of tris (2,2bypyridine) ruthenium () with codeine phosphate, brompheniramine maleate and e
4、phedrine hydrochloride, as well as the linear correlation between enhanced sensitivity intensity and drug concentration, platinum disk (300m in diameter) was used as a working electrode. Parameters affecting separation and detection were optimized. Results Under the optimized conditions, we determin
5、ed the linear range, regression equation and detection limit for the three ingredients. The relative standard deviation of ECL intensity for twelve consecutive injections of 1.010-5kg/L standard sample of three kinds of drug was 2.89% for codeine phosphate, 3.76% for brompheniramine maleate and 3.32
6、% for ephedrine hydrochloride, respectively. Satisfactory results were obtained without interference from sample matrixes. Conclusion The method was successfully applied to the determination of three ingredients in oral solution of compound codeine 3phosphate, with the recovery rate of 100.4% for co
7、deine phosphate, 101.9% for brompheniramine maleate and 99.8% for ephedrine hydrochloride.KEY WORDS: capillary electrophoresis; electrochemiluminescence; codeine phosphate; brompheniramine maleate; ephedrina hydrochloridum复方磷酸可待因口服溶液具有镇咳祛痰，抗过敏，治疗伤风，流感之功效。其中主要成分为磷酸可待因、盐酸麻黄碱、马来酸溴苯那敏、愈创木酚甘油醚和辅料，成分较为复杂，
8、在一般检测方法中相互干扰和影响。文献中已报道的磷酸可待因的含量测定方法有非水滴定法，酸碱滴定法1；盐酸麻黄碱的含量测定方法有非水滴定法，分光光度法1；马来酸溴苯那敏的含量测定方法有非水滴定法1，分光光度法12 ，高效液相色谱法34 ，电化学发光法5。这些方法都有其不足之处，如混合样品中各成分很难同时检测。本文依据三种待测药物磷酸可待因、盐酸麻黄碱和马来酸溴苯那敏的结构(图 1)中的胺基与电化学发光(electrochemiluminescence) 试剂联吡啶钌配合物 Ru(bpy)2+3 发生的电化学发光反应，建立了对其进行含量测定的新方法。毛细管电泳(capillary electroph
9、oresis)已成为一种重要的分4离技术。在分析科学尤其是生命科学及临床医学中起着很重要的作用6。在电化学发光体系中，电化学发光试剂联吡啶钌配合物Ru(bpy)2+3 已被成功地用于免疫分析、DNA 分析、药物分析和机理的研究等诸多领域78 。把毛细管电泳与电化学发光分析法有机结合起来，可以将毛细管电泳的高分离能力与电化学发光高灵敏度检测优点相结合911 。CEECL 联用同时测定复方磷酸可待因口服溶液所含多种混合物中三种药物含量的方法未见报道。本文建立的新方法对于科学准确地控制和管理麻醉及精神药品起到了很好的作用。1 材料与方法1.1 仪器与试剂MPIA 型毛细管电泳电化学发光检测器 (西安
10、瑞迈电子科技有限公司)。 pHs2C 型酸度计(上海华侨仪器厂)。KQ218 超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司) 。毛细管长 50cm、内径为 25m (河北永年光导纤维厂)。联吡啶钌(Sigma 公司)储备液 0.1mol/L：取联吡啶钌约 2.0g，精密称定至 1.8715g，用二次蒸馏水稀释并定容至 25mL，即得 100mmol/L 的储备液，使用前逐级稀释至所需浓度。用 Na2HPO4 和 NaH2PO4(西安化学试剂厂)配制一系列 pH值的磷酸盐缓冲液。实验中所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。5实验中所有进入毛细管的溶液须用 0.22m 醋酸纤维素膜过滤。磷酸可待因和盐酸麻黄碱
11、对照品均由中国药品生物制品检定所提供，纯度分别为 99.8%和 99.7%。马来酸溴苯那敏原料药执行企业内控质量标准，由沈阳新地药业有限公司提供，含量在 98.5%以上(国药准字 H20052113)。复方磷酸可待因口服溶液购自香港澳美制药厂。批号：0706302，0803302，0804302；规格：每 5mL样品中含有磷酸可待因 4.5mg，马来酸溴苯那敏 2.0mg，盐酸麻黄碱 5.0mg 和愈创木酚甘油醚。1.2 实验方法混合对照品溶液的配制：准确称取经 105干燥至恒重的磷酸可待因、盐酸麻黄碱、马来酸溴苯那敏对照品分别约为45，50，20mg，置 50mL 量瓶中，用二次蒸馏水溶解并
12、稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液 1mL，置 10mL 量瓶中，用二次蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，得混合对照品溶液。用 0.22m 醋酸纤维素膜过滤,取过滤液进行测定。用前逐级稀释至所需浓度。样品溶液的配制：取复方磷酸可待因口服溶液 1mL，置 10mL容量瓶中，用二次蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，再用 0.22m醋酸纤维素膜过滤,取过滤液进行测定。6毛细管的预处理与检测池的安装：将未涂层的新毛细管使用前依次用 1mol/L NaOH 溶液在 60冲洗 30min，使毛细管内壁生成硅醇基，再依次用 0.1mol/L NaOH 溶液、二次蒸馏水、运行缓冲液各冲洗 10min。每次使用前毛细管
13、分别以 NaOH 溶液、二次蒸馏水、磷酸盐缓冲液各冲洗 5min。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗。2 结果2.1 分离条件的优化分离高压对 ECL 光强的影响： 当毛细管两端所加分离高压在 319kV 范围内变化时，发现当其高于 15kV 时，基线噪音变得明显，可能是由于较大的分离电压使毛细管内焦耳热效应增加，峰形变差。另一方面，参照进样体积公式12：Vi=Ei ti Vcapillary/Estm，Ei 表示进样电压，Es 表示分离电压，ti 表示进样时间，tm 表示分析物的迁移时间，Vcapillary 表示毛细管的体积。可看出随着分离高压的增大，进样量的减少可能导致发光效率的降低。实验中采
14、用 15kV 作为分离电压。运行缓冲液的浓度及 pH 值对 ECL 光强的影响： 因运行缓7冲液的 pH 值影响分离中的电渗流大小和分析物所带电荷，从而影响其分离效果。实验中考察了 20mmol/L pH 值 5.09.5 范围内磷酸盐缓冲液对 ECL 光强的影响，发现当 pH 值为 7.16 时发光强度达到最大，而后 ECL 光强随着 pH 值的增大而减小。固定运行缓冲溶液 pH 值到 7.16，考察了磷酸盐缓冲液浓度在 1050mmol/L 范围内变化时 ECL 光强的变化，当浓度大于 30mmol/L 时，ECL 光强有所降低，可能是因为离子强度的增加导致焦耳热效应的增加。故在实验中选择
15、 pH 值为 7.16 的 20mmol/L 的运行缓冲液。进样高压和进样时间对 ECL 光强的影响： 仪器采用自动电迁移进样，按 2.1 中公式，对于特定分析物和毛细管，电动进样体积决定于进样时间 ti，进样电压 Ei 和分离电压 Es。其毛细管柱效按以下公式评价1：N=5.54(tm/W0.5h)2，N 表示理论塔板数，tm是迁移时间，W0.5h 表示半峰宽。在考察进样时间对 ECL 光强的影响时发现当其在 319s 变化时，在 10s 时 ECL 光强达到最大。因此选择进样时间为 10s。当进样高压在 319kV 范围内变化时，随着进样高压的增加，ECL 光强增强但是柱效降低。在进样高压
16、达到15kV 之后，电泳峰开始变宽，因此选择进样电压为 15kV。电化学发光反应是在工作电极表面发生。因此，ECL 光强依赖于工作电极表面扩散层分析物的浓度，在高的进样电压下，较多的分析物进入扩散层，产生较强的 ECL 光强。然而，当进样量过大时，分析物的散布导致峰展宽，柱效降低。综合各因素，将进样时间和进样电压8确定为 10s，15kV。2.2 检测条件的优化2.2.1 检测电位对 ECL 光强的影响施加在电极上的电压引发化学发光反应，从而影响其 ECL 发光强度。因此，检测电位应至少高于发光试剂的氧化电位，以使其生成 Ru(bpy)3+3。当检测电位在小于 1.10V 时，光信号为零。在1.101.30V 范围内变化时，发光强度随着检测电位的增加而增加，当检测电位为 1.22V 时，发光强度达到最大，而后随着检测电位的增加而减小，故选择 1.22V 为检测电位。2.2.2 检测池中溶液浓度及其 pH 值对
