《CCK-8对LPS诱导大鼠TASMCs CuZn-SOD基因表达影响的受体机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CCK-8对LPS诱导大鼠TASMCs CuZn-SOD基因表达影响的受体机制（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1CCK-8 对 LPS 诱导大鼠 TASMCs CuZn-SOD 基因表达影响的受体机制作者：董国凯, 谷振勇, 马丽琴,李娜,马春玲 ,丛斌【摘要 】 目的 探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8) 对体外脂多糖(LPS)诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞(TASMCs) CuZn-SOD 基因表达影响的受体机制。方法 用贴块法培养大鼠 TASMCs，经 CCK-8、LPS、CR-1409、 CR-2945、CCK+LPS、CR-1409+LPS、CR-2945+LPS、CR-1409+CCK-8+LPS、CR-2945+CCK-8+LPS 及溶剂单独或共同孵育细胞，用 RT-PCR 技术检测 CuZn-
2、SOD mRNA表达。结果 对照组 TASMCs CuZn-SOD mRNA 低水平表达，LPS 诱导 TASMCs CuZn-SOD mRNA 表达上调(P0.05)，CCK-8 预处理后，LPS 对 TASMCs CuZn-SOD mRNA 表达的诱导作用可部分受抑，预先用 CR-1409（110-5 mol/L） 、CR-2945（110-5 mol/L）处理后，再分别加入 LPS 和 CCK-8，CR-1409+CCK-8+LPS、CR-2945+CCK-8+LPS 两组 CuZn- SOD mRNA 表达均高于 CCK-8+LPS 组（ P0.01） ，但仍低于 LPS 组(P0.0
3、5)。结论 CCK-8 通过其受体下调 LPS 对 TASMCs CuZn-SOD 基因表达的诱导作用，其中 CCK-BR 较 CCK-AR 作用稍大。 2【关键词】 八肽胆囊收缩素；脂多糖；血管平滑肌细胞； CCK受体；铜-锌超氧化物歧化酶Abstract： Objective To investigate the effect of CCK-8 receptor on LPS-induced CuZn-SOD mRNA expression in rat TASMCs. Methods Rat thoracic aorta smooth muscle cells (TASMCs) from
4、 the attachment-block culture were incubated with NS, LPS (0.1 mg/L), CCK-8 (110-8 mol/L), CR-1409 (110-5 mol/L, the specific antagonist of CCK-AR) and CR-2945 (110-5mol/L, the specific antagonist of CCK-BR), respectively or in combination. The expressions of CuZn-SOD mRNA were assayed by RT-PCR. Re
5、sults The expressions of LPS-induced CuZn-SOD mRNA were up-regulated, compared with the control group (P0.05). Subsequent to CCK-8 pretreatment, the induction of LPS to the expressions of CuZn-SOD mRNA in TASMCs was partially inhibited. Following pretreatment with CR-1409 (110-5 mol/L) and CR-2945 (
6、110-5 mol/L), LPS and CCK-8 were respectively added. The expressions in CR-1409+CCK-8+LPS and CR-2945+CCK-8+LPS groups were higher than CCK-8+LPS group (P0.01), but were still lower than those of LPS group 3(P0.05). Conclusion CCK-8 can down-regulate LPS-induced CuZn-SOD mRNA expression in TASMCs by
7、 means of its receptors CCK-AR and CCK-BR, of which CCK-BR had slightly greater induction than CCK-AR.Key words: cholecystokinin octapeptide; lipopoly-saccharides; thoracic aorta smooth muscle cells; cholecystokinin receptor; Cu-Zn superoxide dismutase内毒素休克是严重危害人类健康的病理过程，死亡率极高。血管调节机制紊乱是内毒素休克特征性病理改变之
8、一，主要表现为内毒素休克发生早期主动脉压下降、肺动脉压升高。在内毒素休克的发病过程中氧自由基（oxygen-derived free radicals，OFR）的生成增多与血管调节机制紊乱密切相关1 。八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）是一种小分子脑肠肽，通过其受体发挥调节作用，其受体属于 G 蛋白耦联受体，根据亲和力以及生物学功能的不同，分为 A、B 两种亚型，其特异性阻断剂可拮抗 CCK-8 的作用2 。CCK-8 具有明确的抗内毒素休克作用，可明显降低内毒素休克大鼠的死亡率，本实验室已有研究3表明，4体外脂多糖(LPS)可引起培养的血管平
9、滑肌细胞总超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，诱导 CuZn-SOD、Mn-SOD mRNA 表达上调，而 CCK-8 可呈剂量依赖性抑制这一作用，翻转导致的 SOD 活性降低4 。本实验利用原代大鼠胸主动脉平滑肌细胞(thoracic aortic smooth muscle cells，TASMCs) ，在以往研究基础上观察 CCK-8对 LPS 诱导 TASMCs CuZn-SOD 基因表达的受体机制，进一步研究 CCK-8 缓解内毒素休克血管动力学紊乱的分子机制。1 材料和方法1.1 材料 大肠杆菌脂多糖 (E coli LPS)、硫酸化 CCK-8 及胰蛋白酶(Sigma 公司)；DM
10、EM 培养基(Gibco 公司)；RT-AMV(TAKARA 公司)；Trizol(北京赛百胜)；胎牛血清(北京元亨圣马公司)；MCO-175 型 CO2 培养箱(日本三洋株式会社)；其余试剂均系国产分析纯。雄性、健康无热原 Wister 大鼠 55 只，(12020)g，由河北省实验动物中心提供。1.2 方法1.2.1 大鼠 TASMCs 的分离、培养和预处理 用贴块干涸法培养大鼠 TASMCs。大鼠经戊巴比妥钠（ 45 mg/kg）麻醉后，于无菌条件下迅速取出胸主动脉，放入无血清的 DMEM 培养液中，5仔细剥去外膜，纵行剖开血管，轻轻刮去内皮细胞，以无血清的培养液洗 23 次，剪碎成 1
11、 mm1 mm 大小,移入培养瓶中，均匀种植于瓶底壁, 加入含 200 ml/L 胎牛血清、1105 U/L 青霉素及100 mg/L 链霉素的 DMEM 培养基，瓶底朝上置于 CO2 培养箱中，待组织块边缘干涸后(约 3.5 h)，轻轻翻转培养瓶使组织块完全浸泡于培养液中，静止 5 天，观察后换液。细胞铺满瓶底 80% 以上时，加入 2.5 g/L 胰蛋白酶消化，12 分装传代。实验用 58 代细胞。1.2.2 实验分组 CCK-8 组、LPS 组、CR-1409 组、CR-2945 组、CCK+LPS 组、CR-1409+LPS 组、CR-2945+LPS 组、CR-1409+CCK-8+
12、LPS 组、CR-2945+CCK-8+LPS 组及对照组。各组分别加入相应成分，其中 LPS 为 0.1 mg/L，CCK-8 为 110-8 mol/L, CR-1409 和 2945 均为 110-5 mol/L，对照组加等体积的生理盐水, 继续培养至相应时间后收集细胞。实验独立重复 3 次。1.2.3 半定量 RT-PCR 检测 SOD mRNA 表达 TASMCs 预处理 4 h,Trizol 一步法提取细胞总 RNA，严格按说明书进行操作，实验所用金属器械及玻璃器皿均经过 180，6 h 干烤，移液器头及 EP 管均经过 DEPC 水处理。取上述总 RNA 提取液各 1 l 行纯度
13、与完整性的鉴定，取总 RNA 11 l(5.5 g)，在 AMV 逆转录酶作6用下，用随机引物合成 cDNA。根据 GenBank 中 SOD cDNA 序列(CuZn-SOD：Z21917)，用引物设计软件 Primer 5.0 设计特异性引物。CuZn-SOD 上游引物：5-CAG GCA TCT TGT TCT CC-3，下游引物：5-AGC GAC CTC AAA CTC AC-3(276bp)；内参对照 -actin 上游引物：5-GAG GGA AAT CGT GCG TGA C-3，下游引物：5-CTG GAA GGT GGA CAG TGA G-3(450 bp)。在含有 15
14、 mmol/L MgCl2, 1U Taq DNA 聚合酶及 20 pmol/L SOD 特异性引物的 25 l 反应体系中,进行 cDNA 的聚合酶链反应 (PCR)。PCR 循环参数为: 预变性 94 3 min；变性 94 45 s；复性 54 45 s (-actin)，50 45 s (Cu-Zn SOD)；延伸 72 45 s，进行 30 次循环后进一步延伸72 5 min。取 15 l 合成的 PCR 反应产物经 18 g/L 琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳 100 V 稳压 50 min，紫外灯下观察结果、拍照，并扫描至计算机中。用江苏捷达凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析，C
15、uZn SOD 与 -actin 的光密度比值代表 mRNA 相对表达水平(图1)。1.3 统计学处理 采用 SPSS 13.0 统计软件包进行统计分析，数据用s 表示，组间比较行单因素方差分析(One-way ANOVA)，7有显著差异者进一步用最小显著性极差法检验进行两两比较。检验水准：=0.05。2 结果2.1 CCK-8、CR-1409 及 CR-2945 对 LPS 诱导的 CuZn-SOD mRNA 表达的影响 对照组 TASMCs 存在着 CuZn-SOD mRNA 基础表达；加入 LPS 处理 4 h，CuZn -SOD mRNA 表达明显上调，与对照组相比差异有显著性(P0.01)；预先 30 min 加入 CCK-8，则 LPS 诱导的 CuZn-SOD mRNA 表达上调可部分抑制，与 LPS 组相比有显著差异（P0.01） ；而预先 10 min 分别给于CR-1409 及 CR-2945，则部分受抑的 CuZn-SOD mRNA 表达均上调，与 LP
