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1、1C60-氮芥对正常组织的氧化损伤防护效应【摘要】 目的 检测 C60-氮芥在 Lewis 肺癌荷瘤小鼠各器官中总超氧化物歧化酶（T-SOD） 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX ） 、丙二醛（MDA）含量, 并探讨其对动物正常器官的氧化损伤的保护效应。方法 通过一系列加成反应所合成的一种 C60-氮芥,以 Lewis肺癌荷瘤小鼠为研究对象, 动物模型成功建立后，48 只荷瘤鼠随机分为 8 组：生理盐水组（ NS 组） 、C60 组、氮芥组、C60-氮芥组、NS+辐射组、C60+辐射组、氮芥+辐射组、C60-氮芥+辐射组, 化学比色法测定组织匀浆 GSH-PX 活力，T-SOD 和 MDA 含
2、量。结果 C60-氮芥、氮芥降低小鼠骨髓中 GSH-PX 活力（P0.05） ，降低了小鼠肝脏、骨髓中 T-SOD 活力（P0.05） ，提高了小鼠骨髓、肝脏中 MDA 含量（P0.05） ，但 C60-氮芥组与氮芥组比较所受的毒性损伤较小（P0.05） ，同时 C60 降低了小鼠骨髓中 MDA 含量（P 0.05） ；在电离辐射条件下，C60-氮芥、氮芥显著降低了小鼠脑、肝、脾、肾、骨髓中 GSH-PX 活力、T-SOD 活力，提高了MDA 含量（P0.05） ，但 C60-氮芥组与氮芥组比较所受的毒性损伤较小（P0.05） ；C60 组小鼠骨髓中的 GSH-PX、T-SOD 活力较NS 组
3、高（P0.05） ， C60 组小鼠骨髓、脾脏中的 MDA 含量较 NS组低（P0.05） ，其余各组织组间比较无明显差异。结论 C60-氮芥较氮芥对动物各正常器官的氧化损伤和辐射损伤具有保护作用。其机制可能是通过药物在机体内的生物分布和 C60 能够清除自由基2减少脂质过氧化反应和保护抗氧化酶的损伤起辐射保护的途径实现的。 【关键词】 C60-氮芥；谷胱苷肽过氧化物酶；丙二醛；总超氧化物歧化酶；自由基；辐射防护富勒烯（fullerene ）是由一系列不同数目的碳原子组成的一类物质的总称，C60 是富勒烯家族的成员之一，直径约为 1 nm，是目前作为药物载体研究的主流纳米材料之一，被应用于作为
4、制作新型药物因子的模板和对其生物性能的研究，包括抗病毒、抗氧化、趋药性和神经保护功能1 。研究表明：富勒烯及其衍生物没有致癌作用，也没有急性中毒和遗传毒性2-3 ，但富勒烯及其衍生物的毒性研究还刚刚开始,尚不能作任何肯定的结论。氮芥是最早应用于临床肿瘤治疗的一类烷化剂。C60-氮芥是利用 C60 和氮芥加热条件下通过一系列加成反应所合成的一种C60-化疗药物复合物。本实验通过研究 C60-氮芥对各器官超氧化物歧化酶（SOD） 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX） 、MDA 含量，初步探讨其在 Lewis 肺癌荷瘤小鼠中对动物正常器官的辐射生物学效应4-5 。1 材料和方法31.1 实验动物健康
5、、雄性、6 周龄 C57BL 纯系小鼠，体重（ 202）g,由北京中国药科院实验动物心提供。1.2 主要试剂C60-氮芥由中国医学科学院上海应用物理研究所纳米生物研究室李文新教授课题组合成，纯度99%，不溶于水。C60 为武汉大学三维碳族材料有限公司产品，纯度99%，不溶于水。1.3 水溶性药物制备称取 9.93 mg C60-氮芥与 1 165 mg PVP（聚乙烯吡咯烷酮）溶于 100 ml 氯仿，超声震荡，溶解得一橙黄色液体，利用真空旋转抽滤机旋转蒸发至干，加 100 ml 双蒸水溶解得一橙黄色澄清溶液，此溶液即为溶解的 C60-氮芥溶液（该方法由中国医学科学院上海应用物理研究所纳米生物
6、研究室李文新教授课题组提供） 。分别称取 C607.20 mg、氮芥 2.93 mg，以同种方式制得 C60 溶液、氮芥溶液。41.4 动物模型制备取生长良好的 Lewis 肺癌荷瘤小鼠的肿瘤组织肿瘤（g）生理盐水(ml)为 13 的比例匀浆 ，制备成细胞密度 2106/ml 的细胞悬液,采用 4 号细针注射于 C57BL 纯系小鼠左侧腹股沟，每只注射 0.2 ml。一般于注射 7 天后可见小鼠腹股沟处肿块长出。1.5 动物处理动物模型成功建立后， 48 只荷瘤鼠随机分为 8 组：NS 组、C60 组、氮芥组、C60-氮芥组、NS+ 辐射组、 C60+辐射组、氮芥+辐射组、C60-氮芥+辐射组
7、，各组分别给予相应药物 0.025 mmol/kg， NS 组和 NS+辐射照射组则给予 NS 0.5 ml,腹腔给药，连续给药 5 天。其中 NS+辐射组和 C60+辐射组在给药开始时，同时给予钴 60 机 射线体外照射，照射剂量为 1.5 Gy，连续照射 3天。于第 6 天活杀小鼠。1.6 测定方法化学比色法测定组织匀浆 GSH-PX 活力、T-SOD 和 MDA含量5-6 。51.7 统计学处理所有数据均以s 表示， 组间比较采用 F 检验和 t 检验；P 0.05 认为差异有统计学意义。2 结果2.1 C60-氮芥对小鼠器官 GSH-PX 的影响C60-氮芥组、氮芥组、C60 组与 N
8、S 组比较，小鼠骨髓中GSH-PX 活力均有所下降（P0.05） ，但 C60-氮芥组与氮芥组相比较，GSH-PX 活力降低的程度较轻（P0.05） 。其余各组组间比较无明显差异。见表 1。表 1 C60-氮芥对小鼠器官 GSH-PX 活力的影响（略）2.2 C60-氮芥对小鼠器官 T-SOD 活力的影响C60-氮芥组、氮芥组分别与 NS 组、C60 组比较，小鼠肝脏、骨髓中 T-SOD 活力显著降低（P0.05） ，C60 组小鼠肝脏 T-SOD活力较 NS 组高（P 0.05） ，但 C60-氮芥组与氮芥组相比无显著性差异；C60- 氮芥降低了小鼠脾脏中的 SOD 活力（P0.05） ，其
9、余各组织组间比较无明显差异。见表 2。表 2 C60-氮芥对小鼠器官 T-6SOD 活力的影响（略）2.3 C60-氮芥对小鼠器官 MDA 含量的影响C60-氮芥组、氮芥组与 NS 组、C60 组比较小鼠骨髓中的MDA 含量显著提高（P0.05） ，同时 C60 组的小鼠骨髓中 MDA含量与 NS 组比较有所降低（P 0.05） ，C60-氮芥组与氮芥组小鼠骨髓中 MDA 含量相比无显著性差异；C60-氮芥组与 NS 组、C60组、氮芥组比较小鼠脾脏中的 MDA 含量显著提高（P0.05） 。其余各组织组间比较无明显差异。见见表 3。表 3 C60-氮芥对小鼠器官 MDA 含量的影响（略）2.
10、4 C60-氮芥对小鼠器官 GSH-PX 辐射抗性的影响在电离辐射条件下，C60-氮芥组、氮芥组与 NS 组、C60 组比较，小鼠脑、肝、脾、肾、骨髓中 GSH-PX 活力均有所降低（P 0.05） ，但 C60-氮芥组与氮芥组相比较，小鼠脑、肝、脾、骨髓中 GSH-PX 活力下降的程度均有所降低（P0.05） ；C60 组小鼠骨髓中的 GSH-PX 活力较 NS 组高（P 0.05） ，其余各组织组间比较无明显差异。见表 4。表 4 电离辐射下 C60-氮芥对小鼠器官GSH-PX 活力的影响（略）2.5 C60-氮芥对小鼠器官 T-SOD 活力辐射抗性的影响7在电离辐射条件下，C60-氮芥组
11、、氮芥组与 NS 组、C60 组比较，小鼠脑、肝、脾、肾、骨髓中 T-SOD 活力有所降低（P 0.05） ，但 C60-氮芥组与氮芥组相比较，小鼠脑、肝、骨髓中T-SOD 活力降低程度较轻（P0.05） ；C60 组小鼠骨髓中的 T-SOD 活力较 NS 组高（ P0.05） ，其余各组织组间比较无明显差异。见表 5。表 5 电离辐射下 C60-氮芥对小鼠器官 T-SOD 活力的影响（略）2.6 C60-氮芥对小鼠器官 MDA 含量辐射抗性的影响在电离辐射条件下，C60-氮芥组、氮芥组与 NS 组、C60 组比较，小鼠脑、肝、脾、肾、骨髓中 MDA 含量有所提高（P 0.05） ，但 C60
12、-氮芥组与氮芥组相比较，小鼠脾、骨髓中MDA 含量提高程度较轻（P0.05） ；C60 组中小鼠脾、骨髓中的MDA 含量较 NS 组低（P0.05） ，其余各组织组间比较无明显差异。见表 6。表 6 电离辐射下 C60-氮芥对小鼠器官 MDA 含量的影响（略）3 讨论靶导向药物治疗的目的在于提高药效和降低药物毒性。药物8通过与药物载体的结合，可以选择性的进入靶组织，从而导致药物在靶细胞或甚至是靶细胞的特定区域高浓度聚集，提高药效，降低药物对正常组织的毒性作用。目前，被研究的药物载体的种类很多，一般可以分为三大类：微颗粒载体、可溶性载体、细胞载体6 。纳米颗粒载体即为一种微颗粒载体。纳米粒子是一
13、种介于原子团组与宏观物质之间的一种物质状态。由于它的特殊性质，所以纳米粒子具有一定的体积效应、表面效应、量子尺寸效应和量子隧道效应7 。在本实验中，我们通过测定各用药组小鼠正常器官组织MDA、SOD、GSH-PX 活力，来反映各组小鼠正常器官组织细胞的细胞损伤程度和器官清除自由基的能力，从而间接反映出各用药组药物对机体正常器官的损伤程度，也就是毒性作用的高低。实验结果表明，C60-氮芥对小鼠骨髓、肝、脾有一定的损伤作用，但对骨髓的损伤与氮芥对骨髓的损伤相比明显降低，而对肝脏的损伤与氮芥相比则无明显差异，对脾脏损伤则比氮芥要高。同时，C60 对骨髓有一定的保护作用。由于 C60、C60-氮芥不溶
14、于水，所以在本实验中利用 PVP这种多聚乙烯粉末将其包裹后经过一系列溶解过程得到溶于水的C60 和 C60-氮芥溶液。这种溶液中的 C60-PVP 复合体、C60-氮芥9-PVP 复合体的直径约为 200 nm。经腹腔给药后，这两种复合体都容易被肝脏中的枯否细胞和脾脏中的单核-巨噬细胞系统吞噬，从而造成 C60-氮芥在这些器官中聚集，对这些器官损伤加重。有文献指出，药物与纳米颗粒结合后，经系统给药，在体内迅速分布，然后被巨噬细胞系统所吞噬，即使给予 PEG 剂量也不能完全清除他们在肝脏和脾脏的分布。由于骨髓也富含内皮网状细胞和巨噬细胞，所以可以摄取一定量的 C60 和 C60-氮芥。国内李宇国
15、等8也发现一种水溶性 C60 衍生物 C60（OH）X 在小鼠体内主要分布于骨、肝、脾、骨髓。水溶性的 C60 及其衍生物是一种强效自由基清除剂是早有定论的。在骨髓中聚集的 C60，由于其可以降低内源性自由基对骨髓的损伤，所以表现出对骨髓具有一定的保护作用。至于C60-氮芥对骨髓的作用，我们考虑是因为 C60-氮芥具有 C60 和氮芥两种活性基团，且氮芥对骨髓的损伤作用超过 C60 对骨髓的保护作用，因而表现出 C60-氮芥对骨髓有一定的损伤，但与氮芥对骨髓的损伤相比损伤程度降低。C60-氮芥对脑组织影响不大是因为其可能不能通过血-脑屏障。对肾脏组织影响较小可能与其在肾脏中代谢较快有关。C60
16、 是典型的缺电子烯烃，具有很强的亲电子亲和能力，而自由基离子和自由基都是带有正电子的氢离子或羟基。因此，C60与自由基离子或自由基很容易发生结合反应，这也是 C60 能够清除自由基的化学结构基础9 。一般认为，C60 与自由基反应是以10C=C 双键的多重加成反应为主。由于 C60 具有这种强效的清除自由基特性，被称为“自由基海绵” 。利用 C60 及其衍生物降低脑缺血/ 再灌注中的脑组织受损程度，就是利用 C60 能够强效清除自由基的这种特性10 。本部分实验结果显示：C60+ 辐射组骨髓、脾组织中的 T-SOD 值高于单纯辐射组，MDA 值则低于单纯辐射组；C60+辐射组骨髓中 GSH-PX 测定值高于单纯辐射组，脾组织中 GSH-PX 则无明显差异；肝脏、脑、肾组织各测定值均无明显差异。之所以出现这样的结果，我们考虑： 射线照射机体后，机体组织产生大量的自由基，而
