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1、1B 组柯萨奇病毒对心肌细胞感染模式的研究作者：张中海，张琦，闫长栋，钟照华【摘要 】 目的 观察 B 组柯萨奇病毒(Coxsackie virus B，CVB)在原代心肌细胞中的感染特点，从而研究 CVB 对心肌细胞的致病机制。方法 原代培养 Balb/c 乳鼠心肌细胞，并获得纯化的心肌细胞。使用 B 组柯萨奇病毒嗜心肌毒株 3 型(CVB3m) 攻击原代心肌细胞，观察病毒感染心肌细胞后心肌细胞的细胞病变、超微结构和心肌酶的变化。结果 成功原代培养了 Balb/c 乳鼠心肌细胞。心肌细胞在病毒感染后，细胞病变(CPE)不明显，与在 HeLa 等细胞中的典型CPE 不同。心肌细胞在 CVB3m
2、 感染后保持细胞形态和博动超过 2周时间。电镜显示心肌细胞结构正常，细胞器数量增加，在心肌细胞胞质中可见晶格样病毒颗粒排列。培养细胞的上清液中心肌酶升高。结论 CVB 在原代心肌细胞中表现为持续感染， CVB 在心肌细胞中的致病机制不同于 HeLa 细胞。 【关键词】 心肌细胞;B 组柯萨奇病毒;Balb/c 乳鼠;原代细胞培养Abstract: Objective To investigate the characteristics of Coxsackie virus B (CVB) on primarily cultured myocardial cells and to explore
3、 the pathogenesis of cardiomyocytes.Methods 2Cardiomyocytes from Balb/c suckling mouse were cultured in vitro, and purified myocardial cells were obtained. The cultured myocardial cells were attacked with CVB3m, a myocardial tropic Coxsackie virus B strain. The cytopathic effect (CPE) and ultrastruc
4、ture of the CVB3m-infected myocardial cells were observed. The variations of myocardial enzymes in the supernant of the culture medium were determined.Results The cardiomyocytes from neonate Balb/c mice were successfully cultured. No apparent CPE could be observed in the cultured myocardial cells fo
5、llowing the CVB3m attack, which was different from the typical CPE in the infections of HeLa cells. The cardiomyocytes retained intact morphology and pulsation for over two weeks as of the infection. The electronic microscopy showed that the myocardial cells had normal ultrastructure, with an increa
6、se in the number of organelles and visible crystally-arranged viral particles in the cytoplasm. The level of myocardial enzymes in the supernatant of the infected myocardial cells was higher than that of the control group.Conclusion CVB can persistently infect cardiomyocytes. The pathogenesis of CVB
7、 on myocardial cells differs from that in HeLa cell.3Key words: cardiomyocytes; Coxsackie virus B; sucking Balb/c mouse; primary cell cultureB 组柯萨奇病毒(Coxsackievirus B，CVB)是病毒性心肌炎和心肌病的主要病因，其敏感动物模型是 Balb/c 乳鼠，如果要离体研究 CVB 对心肌的致病性，必须原代培养 Balb/c 乳鼠心肌细胞1 。CVB 感染细胞通常表现为急性杀细胞病变，例如，宫颈癌细胞HeLa 细胞是 CVB 致病机制研究中最
8、常用的细胞平台，CVB 感染HeLa 细胞后，在 24 h 出现明显细胞病变 (CPE)，细胞变圆聚集，48 h 细胞死亡脱落;理论上，CVB 感染心肌细胞也应该表现为杀细胞效应。但是，分子流行病学研究证明，CVB 可以持续存在心肌组织中。Quigley 等2观察 23 例临床和组织学表现为心肌炎的患者，其中 12 例在平均 43 个月中发展为扩张型心肌病(DCM)，随后 4 例死亡，2 例心脏移植， 1 例痊愈，其余仍为 DCM。本课题利用CVB1 核酸、嗜心肌毒株 B 组柯萨奇病毒 3 型(CVB3m)攻击原代培养的 Balb/c 乳鼠心肌细胞，观察 CVB 在心肌细胞中的感染特点，从而说
9、明 CVB 在心肌细胞中的感染机制。1 材料和方法1.1 材料41.1.1 病毒 CVB3m 由哈尔滨医科大学微生物学教研室惠赠。1.1.2 质粒、细胞与实验动物 pNI4 质粒含 CVB1 cDNA 全序列3，由日本东京大学 Narushi Iizuka 教授惠赠;HeLa 细胞和工程菌株 E. coli DH5 均购自哈尔滨医科大学微生物学教研室;Balb/c乳鼠(出生 4 天内) 购自徐州医学院实验动物中心。1.1.3 主要酶类及试剂盒 质粒小量提取试剂盒 W5001 及DNA 小量胶回收试剂盒 W5211 购自上海华舜生物工程公司。真核转染试剂 Tfx-50 为 Promega 公司产
10、品。RNA 提取试剂盒 TRIzol Reagent 为 Invitrogen 公司产品。Thermo ScriptTM RT-PCR 试剂为 Invitrogen 公司产品。限制性核酸内切酶 EcoR V、ClaI 、PstI、碱性磷酸酶 CIAP 及 Wide rang DNA ladder marker 均为 Takara 公司产品。1.1.4 主要试剂 DMEM/F12 培养基(GIBCO 公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司) ，胰蛋白酶(GIBCO 公司)，胶原酶(Sigma 公司)，兔抗小鼠肌动蛋白(actin)抗体(Santa Cruz公司)，羊抗兔 IgG-TRI
11、TC(北京中杉金桥生物技术公司)，5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU，Sigma 公司)，其余试剂均为国产分析纯。51.1.5 细胞培养液 DMEM/F12，pH 7.27.4，使用时加入15%胎牛血清，1%双抗。消化液为 0.2%胰蛋白酶和 0.1%胶原酶混合液(11)。BrdU 用去离子水配制，加入到 15%DMEM/F12 培养液中，终浓度为 0.1 mmol/L，可以抑制非心肌细胞的生长。1.1.6 50TAE 电泳缓冲液 Tris 碱 242 g、冰乙酸 57.1 ml、0.5 mol/L pH 8.0 的 EDTA 100 ml 溶于终体积 1 000 ml 去离子水中，使用时 150
12、 倍稀释;10加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青、30%甘油混匀后保存于 4;10 g/L 溴化乙锭(EB)溶液：0.2 g EB 溶于 20 ml 去离子水中，混匀后 4避光保存，使用时终浓度为 0.5 g/L;0.7%和 1%琼脂糖凝胶：0.7%和 1%琼脂糖分别溶于 1TAE 中。1.2 方法1.2.1 乳鼠心肌的取材 取出生 14 天内的 Balb/c 乳鼠，75%乙醇消毒皮肤，无菌条件下从胸腔取出心脏，取出的心脏立即放入装有预热 37的 D-Hanks 液的培养皿中，可见到心脏仍然保持搏动。1.2.2 乳鼠心肌细胞的分离和培养 取出的心脏在加有 37的 D-Hanks
13、液的平皿中，洗 12 次，置于无血清无双抗的6DMEM/F12 中，并在其中把心脏剪成体积为 1 mm3 的小块;事先准备好 2 支离心管， 第 1 支加入 5 ml 左右 15%DMEM/F12 培养液(含血清和双抗) ，第 2 支空，其中第 1 支放入 4冰箱中备用。将小块的心肌放入第 2 支空着的离心管中，并加入 1.5 ml 消化液，然后放入到事先准备好的 37的水浴锅中消化，每次消化 11 min，弃上清(保持温度在 37) ，重复 3 次;第 4 次加入消化液 2 ml，消化 20 min，每隔 5 min 摇匀，每隔 10 min 吹吸，以加速心肌细胞的消化，20 min 后将消
14、化液吸出，放入在 4冰箱中的离心管中，重复 3 次。将收集好的心肌细胞 1 500 r/min 离心 7 min，弃上清，用 5 ml 预热 37 的 15%DMEM/F12 培养液重悬;在无菌平皿中用滤网过滤细胞悬液以去除大块有形成分;将过滤好的细胞液收集到培养瓶中，置于 37 5% CO2 孵箱中培养 2 h，吸出尚未贴壁的细胞悬液，转移到 24 孔培养板中，置于 37 5% CO2孵箱中培养， 48 h 后换液，以后每 34 天更换培养液 1 次。定期在倒置显微镜下观察细胞生长的情况并摄影记录。1.2.3 心肌细胞的鉴定 倒置显微镜下常规观察细胞的生长情况，并可见心肌细胞的搏动;超微结构
15、观察：培养的细胞用消化液消化后，1 500 r/min 离心、收集心肌细胞，戊二醛固定，送电镜中心，透射电镜观察并摄片。1.2.4 pNI4 质粒转染心肌细胞 在转染前把心肌细胞的培养7液换成无双抗培养液培养，当心肌细胞 90%成层分布后开始转染，按照转染试剂盒的说明进行。每天倒置显微镜下观察心肌细胞的变化，并在转染后的第 1、3 、6 天吸取心肌细胞的上清液冻存，测定心肌酶。1.2.5 嗜心肌毒株 CVB3m 攻击心肌细胞 培养的心肌细胞90%成层分布后进行病毒接种。方法如下：弃上清，每孔加入稀释好的病毒 100 l，37 5% CO2 孵箱中孵育 1 h，加入细胞培养液至 1 ml，37
16、5% CO2 孵箱中培养。每天在倒置显微镜下观察心肌细胞的变化，并在不同的时间段吸取细胞上清液，测定心肌酶谱和提取病毒 RNA，最后用消化液消化、 1 500 r/min 离心、收集心肌细胞，戊二醛固定，超薄切片，透射电镜观察心肌细胞的超微结构。2 结 果2.1 心肌细胞形态观察 倒置显微镜下，消化后的心肌细胞呈圆形，细胞数为 4.8109/L，2 h 后开始贴壁生长，心肌细胞伸展为圆形、梭形、棒状、星状及分叉状等，12 个呈圆形的胞核，核仁清晰可见，可见心肌细胞搏动，频率为 2030 次/min，搏动细胞达 70%，搏动频率有所不同;24 h 后 95%的细胞均有搏动，当生长成片后可见岛屿状搏动，搏动频率为 80150 次/min( 图 1A);超8微结构观察显示，培养的心肌细胞肌丝发达，游离的核糖体、糖原及线粒体丰富，肌节明显，粗肌丝与细肌丝相间排列形成明显的 Z 线。相邻心肌细胞之间伸出许多突起，由中间连接
