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1、1水溶性阳离子荧光共轭聚合物作为荧光探针测定三磷酸腺苷作者：王运 王伟 何治柯 关洪亮【摘要 】 利用荧光光谱研究了三磷酸腺苷 (ATP)与水溶性阳离子荧光共轭聚合物的相互作用，发现加入 ATP 后，聚合物的荧光强度被显著猝灭，且猝灭程度与 ATP 的加入量成正比，据此建立了测定ATP 的方法。荧光光谱的激发波长选择 395 nm，发射波长为 521 nm，激发狭缝宽度为 10.0 nm，发射狭缝宽度为 10.0 nm。在0.05 mol/L TrisHCl 缓冲溶液(pH=7.4)中，测定 ATP 的线性范围为 8.010-81.010-5 mol/L; 检出限为 2.010-8 mol/L
2、; 回收率在 93.6%105.6%之间; 相对标准偏差在 2.2%6.9%之间。本方法用于三磷酸腺苷二钠药片和鲫鱼肉中 ATP 的测定，获得满意结果。 【关键词】 荧光共轭聚合物;荧光光谱;三磷酸腺苷二钠1 引 言三磷酸腺苷(ATP)是生物体中重要的能量物质1，建立快速、简便监测 ATP 的方法对于深入研究其功能具有重要意义。目前，测2定 ATP 含量的方法主要有电化学分析法 2、生物发光法3、高效液相色谱法4、毛细管区带电泳法5及荧光光谱法6等。但电化学分析法、生物发光法、毛细管区带电泳法和高效液相色谱法存在仪器昂贵、操作繁琐等缺点，而 ATP 检测试剂盒价格较高， 试剂保存条件苛刻，不利
3、于反复使用。虽然检测 ATP 的方法在不断改进，但灵敏度和选择性仍然难以满足实际需要。荧光光谱法具有操作简便、灵敏度高、选择性好等特点，作为荧光探针的有小分子7、聚合物8及量子点等9。水溶性荧光共轭聚合物作为一类新型荧光探针具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点，还具有“分子导线”的功能，能够实现荧光信号的放大，常用于生物大分子和生物小分子的检测等10 13。本实验采用的水溶性阳离子荧光共轭聚合物(WCFP)属于一种聚噻吩衍生物。噻吩是五元环结构，符合休克尔规则，具有适中的能隙、较宽的光谱响应、良好的环境稳定性和热稳定性，是一类性能优异的 电子系共轭光、电材料14,15。利用 WCFP 与
4、ATP 相互作用的荧光光谱特性，建立了以 WCFP 为荧光探针测定 ATP 的新方法，并将本方法应用于三磷酸腺苷二钠药片和鲫鱼肉中 ATP 的测定，结果令人满意。本方法不仅简便、准确，试剂稳定、重现性好，而且具有反应时间短，试剂用量少，污染小等优点。2 实验部分32.1 仪器与试剂LS55 型荧光光谱仪(美国 Perkin Elmer 公司)，Nicolet Evolution 300 型紫外 可见分光光度计(美国热电公司)。本实验所采用的 WCFP 属于一种聚噻吩衍生物，结构见图 1 插图。单体的相对分子量为 285.57，按文献16方法合成。 ATP(相对分子量为605.2，上海伯奥生物科
5、技有限公司 );WCFP 和 ATP 均配制成 2.00 10-5mol/L 的储备液，其中 WCFP 浓度以单位计;其它试剂均为分析纯，所用纯水来自 Aquapro 纯水系统(中国重庆颐洋有限公司，18 Mcm)。0.5 mol/L TrisHCl 缓冲液。2.2 实验方法荧光光谱的激发波长为 395 nm，发射波长为 521 nm，激发和发射光谱宽度带为 10.0 nm。实验考察了缓冲溶液、pH 值、离子强度、干扰离子等对 ATP 猝灭聚合物荧光光谱的影响。3 结果与讨论3.1 ATP 对 WCFP 荧光光谱的影响4由加入 ATP 前后 WCFP 的荧光光谱(图 1)可见，WCFP 的最大
6、发射波长均为 521 nm(曲线 a)。随着 ATP 浓度的增加，WCFP的荧光强度逐步下降(曲线 bi)，但其最大发射波长并未发生改变。3.2 缓冲溶液和酸度的影响考察不同缓冲溶液对体系的影响，发现磷酸盐缓冲溶液对聚合物荧光猝灭较强，影响检测灵敏度;TrisHCl 缓冲溶液较好。当TrisHCl 缓冲溶液浓度从 0.01 mol/L 增大到 0.10 mol/L 时，荧光猝灭程度逐渐增强;当 TrisHCl 浓度达到 0.04 mol/L 时，相对荧光猝灭程度变化趋于平缓。因此，选择 0.05 mol/L TrisHCl 缓冲溶液。图 2 为不同 pH 条件下 ATP 对 WCFP 荧光的影
7、响。在 pH 69 之间，加入 ATP 前后荧光强度较为稳定，并且在此 pH 区间体系被猝灭程度最大。由于此实验是研究生理条件下水溶性阳离子荧光聚合物与 ATP 的相互作用，因此选用反应的最适 TrisHCl 缓冲溶液(pH 7.4)。3.3 工作曲线及检出限5WCFP 浓度对 ATP 测定有一定的影响，当 WCFP 浓度过大时，会导致检测灵敏度变低;而 WCFP 浓度过小又会影响测定线性范围。本实验选择最佳浓度为 4.010-6 mol/L(按单体计)。将不同量ATP 加入到阳离子荧光聚合物溶液中，在最佳实验条件分别测定其荧光强度猝灭值 F，得到工作曲线，其相应的线性回归方程和相关系数分别为
8、 Y=0.81x+10.2，r=0.98，n=5。平行测定 12 次空白溶液的荧光强度，计算其标准偏差，以 3 倍的标准偏差除以标准工作曲线的斜率的方法得检出限为 2.010-8 mol/L。3.4 干扰物质的测定混合体系中阳离子荧光聚合物浓度为 4.0 mol/L，ATP 浓度为 0.4 mol/L，考察了共存物质的干扰情况。结果表明，以相对荧光强度变化为5% 计，共存组分允许存在的浓度见表 1。1000 倍的谷氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、乙醇、蔗糖、葡萄糖、NH4Cl、NaNO3、KF 、NaBr;600 倍的异亮氨酸、甲硫氨酸、NaH2PO4、乙酸钠; 500 倍的 N
9、a2CO3; 300 倍的Na2HPO4、K2SO4; 100 倍的苯丙氨酸、Na3PO4、NaI; 25 倍的有柠檬酸钠、ZnNO3、MgCl2; 12 倍的 La(NO3)3、Al(NO3)3, 测定干扰在 5%以内。小牛胸腺 DNA、牛血清白蛋白(BSA)和腺嘌啉的干扰严重。3.5 样品中 ATP 含量的测定6取 2 片三磷酸腺苷二钠药片( 每片含量 20 mg)，加入三氯乙酸 0.30 g，过滤，用超纯水定容至 100 mL，再逐级稀释至测定ATP 的线性范围之内。新鲜鲫鱼购于当地市场，去除鱼鳞、鱼皮和鱼刺，用表 1 干扰物质的测定error (%)LAlanine5.010-4-3.
10、5NH4Cl5.010-4+3.9LGlutamine5.010-4-1.7NaNO35.010-4+1.1LMethionine2.510-4-3.1CH3COONa2.510-4+2.5LLeucine5.010-4-2.4KF5.010-4-1.5LTryptophane4.010-4-3.8NaBr4.010-4-3.0LThreonine5.010-4-1.5NaI4.010-5-4.6LIsoleucine2.510-4-4.3Na2CO32.010-4-4.2LHistidine5.010-4+2.5K2SO41.510-4-4.5Phenylalanine5.010-5-4.0
11、MgCl21.510-5+2.0CH3CH2OH5.010-4+1.5Zn(NO3)21.010-5+4.5C12H22O112.010-4+3.9La(NO3)35.010-6+3.5C6H12O65.010-4+1.9Al(NO3)35.010-6+3.8NaH2PO42.510-4-2.6Trisodium citrate1.0 10-5-4.5Na2HPO41.2510-4-2.5 牛血清白蛋白 BSA1.010-7-1.5Na3PO45.010-5-2.0 腺嘌呤 Adenine2.010-8-2.5 小牛胸腺 DNA4.810-8-2.2 高速组织捣碎机捣碎。根据文献17处理方法提
12、取 ATP，准确称取 1.0 g 已捣碎鲜鱼肉样品，加 10 倍体积(15 mL)的 4 mol/L HClO4，漩涡混匀器混匀 1 min，冰浴 1 min，重7复 7 次后，以 6000 r/min 离心 30 min，取上清液 2.0 mL，加入1.8 mL 4 mol/L KOH 中和，再以 3500 r/min 离心 5 min，取所得混合溶液稀释到测定 ATP 的线性范围之内。以上测定均以 0.05 mol/L TrisHCl(pH=7.4)控制溶液的 pH 值，ATP 固体标样均在样品制备处理前加入。测定结果见表 2， 取得满意的回收率。表 2 药片及鱼肉中 ATP 含量的测定3
13、.6 作用机理探讨由于 WCFP 带有大量的正电荷，常用于 DNA 快速高灵敏检测，其原理主要基于其与 DNA 之间的静电相互作用18。为了探讨WCFP 与 ATP 的作用机理，考察了离子强度对反应体系的影响(见图 3)。如图 3 所示，固定 ATP 与 WCFP 浓度不变，在反应体系中不断增加 NaCl 的浓度，可以看出，荧光强度比值图 3 离子强度对体系荧光强度的影响Fig.3 Effect of NaCl on the fluorescence intensity of WCFP and WCFPATP at 0.05 mol/L pH=7.4 TrisHCl buffer. The c
14、oncentration of ATP and WCFP were 4.010-7 and 4.010-6 mol/L, respectively.(F0/F)随着溶液中离子强度的增加而减小。这说明水溶性阳离子荧光聚合物与 ATP 的相互作用受离子强8度的影响较大，静电引力是其相互作用的主要作用力，这与文献19报道的 WCFP 与 DNA 的作用主要表现为静电作用是相吻合的。【参考文献】1 Sazani P L, Larralde R, Szostak J W. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126(27): 837083712 Goyal R N, Oyama M, Si
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