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1、1正交实验法优选沙枣花总黄酮提取工艺及沙枣花醇提物体外抗氧化活性的研究作者：王基云，陆钊罡，王丹，肖旭，张振华，姚遥，王锐，王妍【摘要 】 目的研究提取沙枣花(elaeagnus angustifolia blossoms，EAB )中总黄酮的最佳工艺条件,并观察了沙枣花醇提物(the alcohol extracts of elaeagnus angustifolia blossoms，AE-EAB )清除氧自由基的作用。方法以芦丁为对照品,NaNO2- Al(NO3)3-NaOH 显色体系作为显色剂, 采用正交实验方法对沙枣花总黄酮提取方法进行了系统研究。结果最佳提取工艺为 20 倍量 7
2、0%乙醇回流 3 次, 1 h/次。AE-EAB 对氧自由基的清除作用随着浓度的升高而增强。结论 EAB 总黄酮的最佳提取工艺为 A2B2C1D3。AE-EAB 对氧自由基有清除作用. 【关键词】 沙枣花;总黄酮;紫外分光光度法;正交实验; 氧自由基Abstract：ObjectiveTo study the optimal extraction technology of total flavonoids in Elaeagnus angustifolia blossoms( EAB),and the free radicals scavenging effect of the alcoho
3、l extract of Elaeagnus angustifolia blossoms(AE-EAB ) .MethodsUsing Rutin as the evaluating criteria and NaNO2- 2Al(NO3)3-NaOH as chromogenic agent, the extraction condition was studied by orthogonal test.ResultsThe optimal technological conditions were attained by the orthogonal experiment as follo
4、ws: extraction with70% ethanol, ethanol volume 20 ml for 1 g EAB every time, and extracting for 3 times (40 min for each time).The scavenging effect on oxygen free radical was proportional to the concentration of AE-EAB.ConclusionThe optimum extraction technology is A2B2C1D3 . AE-EAB has scavenging
5、effect on oxygen free radical .Key words：Elaeagnus an gustifolia L .;Total flavonoid;UV;Orthogonal design沙枣花为胡颓子科植物沙枣 Elaeagnusan-gustifolia L .的花, 主产于西北地区，在宁夏地区资源非常丰富。据中药大辞典记载, 沙枣花主要含山萘酚、花白素、脂肪油和少量挥发油 ,具有止咳平喘的功能 ,可用于治疗慢性气管炎1 。目前对沙枣花研究较多的是其挥发油成分2，但也有人初步研究了青海省沙枣花黄酮类物质的提取方法3 ，已有人利用沙枣花提取液中的功能成分黄酮类化合物对羟
6、基自由基进行了清除试验研究，发现沙枣花中的黄酮类化合物对羟基自由基有着较好的清除效率4,本实验观察了 AE-EAB3对氧自由基的清除作用，发现 AE-EAB 对氧自由基有清除作用，并随着浓度的升高而增强。本文以提取物中总黄酮含量为指标,采用正交实验设计和紫外分光光度法对沙枣花中总黄酮的提取条件及含量测定进行了系统的研究,为进一步开发利用沙枣花及沙枣资源提供科学依据。1 仪器与试药1.1 仪器旋转蒸发仪 (上海亚荣); SHB-III 型循环式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);KQ-3200 DE 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Mili-Q 超纯水仪(法国);电子天平( 梅特勒
7、- 托利多仪器有限公司);7225N 分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)。1.2 药材与试剂沙枣花采自宁夏医学院旁沙造林，经宁夏区药品检验所中药研究室主任韩文欣鉴定为胡颓子科植物沙枣树Elaeagnus angustifolia L.的新鲜花序。水为超纯水, 其它试剂均为分析纯。芦丁标准品(中国药品生物制品检定所，批号：100080)。2 方法2.1 分光光度法测定沙枣花总黄酮的含量542.1.1 对照品溶液的制备精密称取在 120 干燥至恒重的芦丁对照品 50 mg,置于 25 ml 量瓶中,加甲醇适量 ,置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取 10 ml,置 100 ml
8、量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每 1 ml 中含无水芦丁 0.2 mg)。2.1.2 标准曲线的制备精密吸取标准溶液 1，2 ，3，4，5，6 ml 置 25 ml 量瓶中, 各加亚硝酸钠溶液 1. 00 ml,混匀, 放置显色 6 min,加 10%硝酸铝溶液 1 ml,摇匀，放置 6 min，加氢氧化钠试液10 ml,再加水至刻度，摇匀，放置 15 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法在 500 nm 波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程 Y=10.316X-0.002 6,相关系数 r=0. 999 2,线性关系良好。见表 1，图 1。
9、表 1标准曲线测定数据图 1 芦丁浓度- 吸光度标准曲线2.1.3 供试品溶液制备取本品粗粉 1 g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲醇 90 ml，加热回流至提取液无色，转移至 100 ml 量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取 10 ml,置 100 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。紧密量取 3 ml，置 25 ml 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定吸光度。52.1.4 稳定性实验精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 3 ml置 25 ml 容量瓶,分别按照“2.1. 2”项
10、中“加亚硝酸钠溶液 1. 00 ml”起,至“ 加氢氧化钠试液 10 ml,再加水至刻度，摇匀，放置”操作, 用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白,分别在 2, 5, 15, 30, 45, 60 min 测定吸收度,结果表明, 对照品吸收度 RSD=0.764 (n=6),样品吸收度 RSD=4.556,说明稳定性较好。结果见表 2。表 2 稳定性实验结果2.1.5 精密度实验精密吸取同一份对照品和供试品溶液各 5 份, 每份 3 ml 置 25 ml 容量瓶, 按照“2.1.2 项中 “加亚硝酸钠溶液 1. 00 ml”起,至“ 加氢氧化钠试液 10 ml,再加水至刻度，摇匀，放置”操作,
11、用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白,测定吸收度,结果表明,对照品吸收度 RSD=0.185% (n=5),样品吸收度 RSD=4.141% (n=5),说明精密度较好。数据见表 3。2.1.6 重复性实验精密称定同一批沙枣花粉末 5 份各 1.0 g,按照“供试品溶液的制备”方法制得供试品溶液,测定吸收度, 结果表明,RSD=4.214,说明重复性较好。结果见表 4。表 3 精密度实验结果表 4 重复性实验结果2.1.7 加样回收率实验6取已知总黄酮含量的沙枣花粉末(含总黄酮 13.41% )3 份,每份 1 g,精密称定,然后照“供试品溶液的制备”项下进行制备，制备后各取 3 ml，同时分别
12、加入已知浓度的芦丁标准液 1.0, 2.0, 3.0 ml，依照上述样品测定的方法测定, 求出回收率结果，结果表明, 3次测定的平均回收率为 105.0%，(RSD=0.525%，n=3)。说明该测定方法测得的结果准确。结果见表 5。表 5 回收率实验结果2.2 总黄酮提取工艺研究2.2.1 乙醇超声提取法称取沙枣花粉末约 1 g,加 100 ml 95%乙醇, 超声波提 1 h,抽滤。滤渣再加 100 ml 95%乙醇, 超声波提取2.5 h,抽滤,合并两次滤液,减压回收乙醇至滤液仅剩 100 ml, 精密量取 10 ml,至 100 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取 3 ml，至
13、25 ml 量瓶中，备用。照标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定吸光度。2.2.2 乙醇回流提取法称取沙枣花花 1 g,加 95%乙醇 100 ml,煮沸 1 h,过滤。药渣再加 95%乙醇 100 ml,煮沸 1 h,过滤。合并 2次滤液,减压浓缩至 100 ml, 精密量取 10 ml,至 100 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取 3 ml，置 25 ml 量瓶中，备用。照“2.1.2”标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起依法测定吸光度。评价二者效果法总黄酮的含量。结果见表 6。表 6 提取方法考察结果72.2.3 正交设计实验供试品制备：称取干燥恒重的沙枣花粉
14、末 10 g,共 9 份按照L9(34)正交设计实验表确定的条件(见表 7)以加乙醇量、乙醇浓度、提取时间、提取次数 4 因素进行超声提取, 提取液过滤浓缩后, 定容在100 ml 量瓶中,取 10 ml 定容置 100 ml 容量瓶中，摇匀,作为供试品溶液。供试品溶液中总黄酮的含量测定：精密吸取正交设计中每份供试品提取液 3 ml 置 25 ml 容量瓶中, 参照“2.1.2”标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠”起测定吸光度。结果见表 8。运用统计软件 DPS v7.05 对数据进行分析，结果可知, 因素 B 差异有显著性(PADC,即乙醇浓度料液比提取次数 提取时间;提取沙枣花中总黄酮
15、的最佳提取条件为 A2B2C1D3，即 70%的乙醇，料液比 120，提取 3次，1 h/次。验证实验表明,此方法都有较好的重复性,方法可行L9(34)正交设计实验, 沙枣花总黄酮提取的最佳工艺为A2B2C1D3，即 20 倍量 70%乙醇, 回流 1 h,回流 3 次。表 7 L9(34)因素水平表 8L9(34)正交设计实验结果表 9 总黄酮含量方差分析结果验证实验：按优选的最佳工艺条件制备 3 份样品。结果见表10。表 10 验证实验82.3 沙枣花乙醇提取对自由基的清除作用6量取 pH 值为 8.2 的 Tris-HCl 缓冲液 5 ml，分别加入原始浓度为 0.5，1，2，4，6 m
16、g/ml 的沙枣花乙醇提取物溶液 0.3 ml，用双蒸水补充至 9.7 ml，置于 10 ml 容量瓶中，混匀，立即加入 3 mmol/L 的邻苯三酚 0.3 ml,迅速摇匀后倒入比色皿中，用 10 mmol/L 的 HCl 为空白液，在 325nm 波长处，每隔 30 s 测吸光度值 1 次，以吸光度值 A 对反应时间 t 作线性关系图，斜率即为 V1,代入式(1),计算出抗氧化剂对超氧阴离子的清除率(Y)。Y(%) =(1-V1/V0)100V0 为加入空白溶剂 70%乙醇溶液 0.3 ml 时的斜率。图 2 沙枣花乙醇提取物清除氧自由基标准曲线从图 2 中可以看出，沙枣花醇提物对氧自由基有清除作用，并随着浓度的升高而增强，但是清除率较低，可能由于其中的抗氧化物质在总提取物中占取的比例较低。但具体是哪类物质起抗氧化作用，对其中抗氧化物质的筛选有待于进
