《慢病毒介导靶向PRL-3 基因的siRNA抑制肝癌细胞的侵袭性》由会员分享，可在线阅读，更多相关《慢病毒介导靶向PRL-3 基因的siRNA抑制肝癌细胞的侵袭性（17页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1慢病毒介导靶向 PRL-3 基因的 siRNA 抑制肝癌细胞的侵袭性作者：黄德好 张琪 李华 陈伟 陈规划【摘要 】 【目的】 探讨肝再生磷酸酶-3(PRL-3)的表达对肝癌细胞侵袭能力的影响。 【方法】 设计、合成 4 对针对 PRL-3 基因siRNA 的寡核苷酸序列，分别构建质粒，转染 293T 细胞，据其对PRL-3 的抑制率，筛选最有效的 PRL-3 基因 RNAi 靶序列，设计并合成其 siRNA 的双链 DNA Oligo，与含绿色荧光蛋白 (GFP)编码基因的 pGCL-GFP 线性化载体连接产生重组慢病毒质粒 LV-PRL3-SiRNA，并行 PCR 和测序鉴定。将 LV-
2、PRL3-SiRNA，pHelper 1.0 和 pHelper 2.0 三种质粒 DNA 共转染 293T 细胞，包装产生慢病毒，以 293T 细胞 GFP 蛋白的表达水平经孔稀释法测定病毒滴度。重组慢病毒感染肝癌 SMCC7721 细胞，行 real time-PCR 和western-blot 验证 PRL-3 基因的沉默效果。用 Transwell 侵袭试验检测 SMCC7721 细胞体外侵袭力的改变。 【 结果】 成功构建 PRL-3 基因 RNA 干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒，浓缩病毒悬液的滴度为 6 108 Tu/mL。和对照组相比， RNA 干扰组SMMC7721 细胞 P
3、RL-3 基因的 mRNA 水平和蛋白水平的抑制率分别为 75%和 63%;其穿过人工基底膜的平均数(14.2 0.8)明显少于空白对照组(33.0 1.6)及非特异性 siRNA 感染组(31.2 0.8)，2侵袭抑制率为 58% (P 0.01)。 【结论】 降低 PRL-3 的表达可抑制肝癌细胞的侵袭能力。 【关键词】 RNA 干扰; 慢病毒; PRL-3; 肝细胞癌Abstract： 【Objective】 To construct recombinant lentiviral vector expressing siRNA targeting PRL-3 gene and explo
4、re its influence on invasive potency of infected hepatocellular carcinoma cell line SMCC7721. 【Methods】 Four sequences of siRNA targeting PRL-3 gene were designed， of which both sense and anti-sense DNA Oligo were designed， synthesized and corresponding plasmids were constructed. The most effective
5、sequence of siRNA was screened by efficiency of PRL-3 gene knock-down in transfected 293T cells and its DNA Oligo was cloned into the pGCL-GFP vector， which contained coding gene of green fluorescent protein (GFP). The resulting recombinant lentiviral vector expressing siRNA targeting PRL-3 gene was
6、 called LV-PRL3-SiRNA， and it was confirmed by PCR and DNA sequencing. 293T cells were co-transfected with LV-PRL3-SiRNA，pHelper 1.0 and pHelper 2.0 and the lentivirus was produced. The titer of virus was tested according to the 3expression level of GFP in 293T cells. SMCC7721 cells were infected wi
7、th recombinant lentivirus and the silencing effect of PRL-3 gene was assessed by real-time PCR and western-blot. The invasive activity of infected SMCC7721 cells was analyzed by Transwell invasion assay. 【Results】 Recombinant lentiviral vector expressing siRNA targeting PRL-3 gene was successfully e
8、stablished and confirmed by DNA sequencing. The recombinant lentivirus with the most effective PRL-3 gene knock-down were harvested from 293T cells with a viral titer of 6 108 Tu/mL. Results of real-time PCR and Western blot showed that compared with control group， PRL-3 expression in SMCC7721 早期血行播
9、散及术后复发是肝细胞癌(HCC) 预后不良的主要原因1 。关于 HCC 转移复发的具体机制尚未完全明了，因此寻找与其恶性进展密切相关的分子标志物显得意义重大。蛋白酪氨酸的磷酸化与去磷酸化分别受蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases， PTKS)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases， PTPs)的调节，是细胞生长、分化等生命活动的重要调节方式，这两种酶的作用失衡可导致蛋白酪氨酸的磷酸化水平异常，从而引起癌症等疾病的发生2。PRL-3 属于 PTP 家族成员，近年研究发现它与人类多种恶性肿瘤的转移复发及不良预后有关3-5。但 PR
10、L-3 与 HCC 生物学行为间的关系尚未见报导。本研究通过慢病毒介导的 RNA 干扰技术抑制肝4癌细胞中 PRL-3 的表达，观察肝癌细胞体外侵袭能力的改变，探讨PRL-3 表达水平与肝细胞癌恶性生物学行为间的关系。1 材料和方法1.1 材 料人肝癌细胞 SMCC-7721、293T 细胞及大肠杆菌 DH5由本院中心实验室保存。慢病毒包装系统由 pGC-LV 载体、pHelper 1.0 载体和 pHelper 2.0 载体三质粒组成，购自吉凯公司，限制性内切酶 Age和 EcoR、琼脂糖凝胶回收试剂盒及 T4 连接酶购自New England Biolabs(NEB)公司， PRL-3 鼠
11、抗人多克隆抗体(ab503276)及鼠抗人 -actin 单克隆抗体(英国 ABCAM 公司)，HRP 标记羊抗鼠二抗、BCA 蛋白质定量试剂盒 (美国 PIERCE 公司)，胎牛血清(美国 GIBCO 公司) ，大量质粒 DNA 提取试剂盒购自Qiagen 公司，细胞总 RNA 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)， SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit(大连宝生物工程有限公司)，细胞可溶性总蛋白提取试剂盒(美国 CST 公司)，dNTP 及 Rnase Inhibitor 购自 Promega 公司。Oligo dT 购自上海生工，RNase-free 的物品都购
12、自 Axygen。Matrigel (BD Pharmingen，Bedford ， USA)， Transwell chambers (Corning， NY， USA)。51.2 方 法1.2.1 构建表达 shRNA 慢病毒载体选择 GeneBank 中人 PRL-3 基因编码区序列 (NM-032611)作为分析序列。设计、合成 4 对针对 PRL-3 基因 siRNA 的寡核苷酸序列，使用 BLAST (Basic local alignment search tool)将选择的干扰序列和相应的基因组数据(人、小鼠、大鼠等)进行序列比对，确信所选序列与其他的基因不具有同源性。分别构建
13、各干扰序列的表达质粒，转染 293T 细胞，据其对 PRL-3 基因的抑制率，确定最有效靶序列为：5-GCTCACCTACCTGGAGAAA-3，设计并合成(上海吉凯基因化学技术公司) 其 siRNA 的 DNA Oligo：5-CCGGCAGCTCACCTACCTGGAGAA ATTCAAGAGATTTCTCCAGGTAGGTGAGCTGTTTTTG-3。阴性对照的核心序列为 5-TTCTCCGAAC GTGTCACGT-3，以下称为NC 序列，其 DNA Oligo： 5-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTT CAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTT
14、TT-3。寡核苷酸经退火形成双链 DNA，经 T4 连接酶与 Age和 EcoR双酶切后的pGCL-GF 线性化载体连接，形成表达 shRNA 的重组慢病毒质粒载体，并行酶切鉴定。用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，6转化 DH5 大肠杆菌，挑取重组阳性克隆行 PCR 筛选，并作测序分析(上海吉凯基因化学技术有限公司) 。PCR 鉴定阳性克隆的引物：上游引物：5-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3; 下游引物：5-GTAATACGGTTATCCACGCG-3。1.2.2 慢病毒包装及滴度测定以 Qiagen 公司的质粒抽提试剂盒对慢病毒包装系统中 3 种质粒即：表达最有效靶
15、序列 siRNA 的重组慢病毒质粒载体 pGC-LV，pHelper 1.0，及 pHelper 2.0，分别进行高纯度无内毒素DNA 抽提，质粒 DNA 溶于除菌的 TE 中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒 DNA 的 A260/A280 在 1.8 2.0 之间。按 Invitrogen 公司 Lipofectamine 2000 使用说明进行共转染293T 细胞，转染后 8 h 更换为完全培养基，培养 48 h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，以 293T 细胞 GFP 蛋白的表达水平经孔稀释法测定病毒滴度。1.2.3 SMCC-77
16、21 细胞分组及感染细胞分为 3 组： SMCC771-CON，空白对照组(CON)，未感染慢病毒的细胞;SMCC7721-NC ，阴性对照组(NC)，即阴性对照7慢病毒 LV-PRL3-SiRNA-neg 感染的细胞组 ;SMCC7721-KD，基因敲除组(KD)，被 RNAi 靶点病毒 LV-PRL3-SiRNA 感染的SMCC7721 细胞。处于对数生长期的靶细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液将细胞悬液(细胞数约为 2 104)接种于 12 孔板中，37.0 ，体积分数为 5% CO2 培养箱培养，待细胞融合度达到约 30%，根据 MOI 值，按实验设计的组别分别加入 RNAi 慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。待感染时间达到 5 d 后收集细胞抽提 RNA 及蛋白分别进行 Real time PCR 及 western blot 检测实验，进而判断靶点的干扰效果。1.2.4 Real time PCR 收集上述 3 组 SMCC
