《急性髓性白血病病人外周血中RIZ1的表达变化与启动子区甲基化相关性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《急性髓性白血病病人外周血中RIZ1的表达变化与启动子区甲基化相关性的研究（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1急性髓性白血病病人外周血中 RIZ1 的表达变化与启动子区甲基化相关性的研究作者：姚晨, 方娟娟, 高丽丽, 丁家华, 束国防 , 余卫平【摘要 】 目的：研究急性髓性白血病病人外周血中肿瘤抑制基因RIZ1 的表达状况和该基因启动子区甲基化状态及两者之间的关系。方法：以 37 例初发急性髓性白血病病人和 15 例正常人外周血标本为研究对象。RTPCR 检测 RIZ1 mRNA 水平,甲基化特异性PCR(MSP)检测 RIZ1 基因启动子区甲基化状态。结果:急性髓性白血病病人标本与正常人标本比较,RIZ1 基因的表达下降,差异具有统计学意义(P0.05)。急性髓性白血病标本中 RIZ1 基因启
2、动子区甲基化率为 29.7%(11/37)。存在甲基化的急性髓性白血病病人外周血标本中,RIZ1 基因表达缺失或降低。结论：RIZ1 基因表达下降与急性髓性白血病的发生有关, 其部分机制在于基因启动子区甲基化。 【关键词】 急性髓性白血病; RIZ1 基因; DNA 甲基化Abstract Objective: To investigate the expression of RIZ1 gene in acute myeloid leukemia and to analyze the relationship between this alteration and the promoter h
3、ypermethylation of RIZ1 gene. Methods: The expression of 2RIZ1 mRNA in peripheral blood from 37 patients of primary acute myeloid leukemia samples and in peripheral blood from 15 normal persons samples was detected by reverse transcripitionpolymerase chain reaction(RTPCR). Methylationspecific PCR(MS
4、P)was used to assay the methylation of RIZ1 gene promotor region. Results: Compared with normal person, the RIZ1 gene expression level decreased significantly in acute myeloid leukemia(P0.05). The Methylation rate was 29.7%(11/37) in acute myeloid leukemia. The expression of RIZ1 mRNA was found to b
5、e lower in the acute myeloid leukemia samples with RIZ1 promoter methylation. Conclusion: Downregulation of RIZ1 gene expression plays an important role in the development of acute myeloid leukemia, and this alteration is partially caused by RIZ1 gene promoter methylation.Key words acute myeloid leu
6、kemia; RIZ1gene; DNA methylationRIZ1 是定位于 1p36 的一个肿瘤抑制基因, 属于核蛋白甲基转移酶超家族成员。RIZ1 失活在多数肿瘤中常见, RIZ1 mRNA 表3达下降或缺失常与 RIZ1 启动子区甲基化有关。研究已经发现,肿瘤抑制基因 RIZ1 mRNA 表达缺乏既见于急性髓性白血病细胞株AML193 又见于慢性髓性白血病细胞株 K562,提示该现象属于髓性白血病的分子改变之一。采用转基因方法证实 RIZ1 具有髓性白血病细胞凋亡诱导作用1。本研究收集急性髓性白血病病人外周血标本,对 RIZ1 mRNA 及其甲基化状态进行检测,旨在探讨急性髓性白血
7、病病人 RIZ1 基因的表达状况及其甲基化状态。1 材料与方法1.1 标本的来源37 例急性髓性白血病病人外周血标本取自东南大学附属中大医院血液科发病初期的病人,其中男 21 例, 女 16 例, 中位年龄 44 岁。按 FAB 标准分型：M15 例,M211 例,M38 例,M510 例,M63 例。15 例健康志愿者的外周血标本作为正常对照,中位年龄 38 岁。1.2 方法1.2.1 RIZ1 mRNA 的检测 (1) 单个核细胞分离与裂解：取肝素抗凝血 510 ml, 生理盐水缓冲液稀释后,用相对密度为 1.077的淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,经生理盐水洗涤后 Trizol 裂解,4
8、-80 保存。(2) 提取总 RNA：采用 Trizol 试剂盒(美国Invitrogen 公司)并按其说明操作。通过紫外分光光度计(HITACH U2001)测 RNA 纯度和浓度。取 OD260 nm/OD280 nm 值在1.82.0 范围内的产物进行逆转录。(3) cDNA 的合成：按 TaKaRa RTPCR 试剂盒说明书操作 ,取 2.0 g 总 RNA 进行逆转录反应。反应体系为 20 l,包含 10RT buffer 2.0 l,2.5 mmolL-1 MgCl2 4.0 l,10 mmolL-1 dNTP 2.0 l,Olid(dT)1.0 l,RNase inhibitor
9、 0.5 l,AMV 1.0 l,无 RNase 水补足反应体系。反应条件为：30 10 min,42 20 min,99 5 min,4 5 min。获得产物置-20 保存。(4) RIZ1 基因的扩增：以获得的 cDNA 为模板通过 PCR 仪(Eppendoff 公司)扩增该基因。RIZ1 基因引物由上海英骏生物技术有限公司设计及合成。上游序列为 5GAAGT GAGGCTTTTCCCTTCT3, 下游序列为5CTCAGGGTTGTCTTCCCCA3,扩增的片段长度为 357 bp。以actin 为内参,上游序列为 5GCAAGAGAGGCATCCTCACC3,下游序列为 5GCACAG
10、CCTGGATAGCAACG3,扩增的片段长度为 240 bp。以 pRIZ1 RH质粒(由加拿大 Saskatchewan 大学癌症研究中心提供 )为模板作为阳性对照,灭菌去离子水为阴性对照。反应体系为 50 l,包含 5PCR buffer 10 l,20 pmolL-1 上、下游引物各 0.5 l,cDNA 10 l,Taq 5DNA 聚合酶 1 l,灭菌去离子水补足体系。反应条件为： 95 5 min,95 30 s,退火温度 RIZ1 53 /actin 65 30 s,72 1 min,共 40 个循环;72 延伸 10 min。产物电泳应用 FR200 紫外可见分析装置(上海复日
11、科技有限公司) 和 smart view TM 2001 生物电泳图像分析软件对电泳条带进行分析。RIZ1 mRNA 相对含量=RIZ1 条带密度/actin 条带密度。1.2.2 RIZ1 基因甲基化的分析 应用 DNA 提取试剂盒(北京天根公司)及甲基化修饰试剂盒( 北京天漠科技开发有限公司) 并按其说明书操作,提取所有标本中单个核细胞 DNA 并加以甲基化修饰。采用甲基化特异性 PCR(methylationspecific PCR, MSP)法, 使用非甲基化与甲基化两对引物检测标本中 RIZ1 基因的甲基化状态。引物设计参照文献2报道, 由上海英骏生物技术有限公司合成。非甲基化引物的
12、上游序列为 5TGGTGGTTATTGGGTGATGGT3,下游序列为 5ACTATTTCACCAACCCCAAGA3;甲基化引物上游序列为5GTGGTGGTTATTGGGCGACGGC3, 下游序列为5GCTATTTCGCCGACCCCGACG3;扩增的片段长度分别为 175 bp 和 177 bp。PCR 反应条件：95 10 min,94 30 s,退火温度56 (非甲基化)/68 (甲基化)45 s,72 1 min,共 40 个循环;最后72 延伸 10 min。获得产物电泳、摄像 ,并随机挑选未甲基化与甲基化扩增产物各 1 例进行测序分析。61.3 统计学分析应用 SPSS 11.
13、5 统计软件,均数比较采用 t 检验,P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 RIZ1 基因 mRNA 表达状况RTPCR 检测结果表明,37 例急性髓性白血病病人和 15 例正常对照者外周血标本中,RIZ1 mRNA 相对含量的平均值分别为0.500.20 与 0.790.12,急性髓性白血病病人外周血中 RIZ1 mRNA 表达低于正常对照者,差异有显著性(P0.05)。其中 15 例急性髓性白血病病人外周血标本 RIZ1 mRNA 表达降低或缺失(图 1)。M. 100 bp DNA 相对分子质量 Marker; 1. 正常人标本; 2. 阴性对照; 36. 急性髓性白血病病人
14、标本; 7. 阳性对照图 1 急性髓性白血病病人及正常人外周血标本中 RIZ1 mRNA 表达状况7Fig 1 Expression of RIZ1 mRNA in acute myeloid leukemia and normal samples2.2 RIZ1 启动子区甲基化状态MSP 法分析表明,37 例急性髓性白血病病人外周血标本中 11例存在 RIZ1 启动子区甲基化, 甲基化率为 29.7%(11/37)。15 例正常人外周血标本均为非甲基化。图 2 显示部分标本检测结果 ,在急性髓性白血病标本中,3、4 、12 和 21 号标本扩增出 175 bp 的 U 片断和 177 bp
15、的 M 片断, 说明存在 RIZ1 启动子区甲基化; 而 9 和 15 号标本仅扩增出 175 bp 的 U 片断, 说明 RIZ1 启动子区未甲基化;8 号正常标本只扩增出 175 bp 的 U 片断, 也说明 RIZ1 启动子区未甲基化。Marker. DNA 相对分子质量标记; M. 甲基化条带(177 bp); U. 未甲基化条带(175 bp); 1、2 、3、5 、 6、7. 3、4、9 、15 、12和 21 号病人标本; 4. 8 号正常标本图 2 急性髓性白血病病人及正常人外周血标本中 RIZ1 基因甲基化状态Fig 2 Methylation status of RIZ1
16、gene in acute myeloid leukemic and normal samples2.3 MSP 产物测序分析8随机挑选未甲基化与甲基化扩增产物各 1 例进行测序,结果与GenBank 中 RIZ1 基因启动子区的序列作对比, 可见未甲基化产物中的胞嘧啶全部替换为胸腺嘧啶,未甲基化序列中的 C 经修饰则转变为T;而甲基化产物所有 CpG 对应的胞嘧啶均保持不变,CpG 以外的胞嘧啶则替换为胸腺嘧啶,从而证实受检 MSP 产物是 RIZ1 基因启动子区的部分序列,甲基化序列中 CpG 的 C 未被硫化,仍为 C。换言之,MSP 产物测序结果中,存在 CpG 表明 CpG 甲基化,存在 TpG 表明CpG 未甲基化( 图 3)。因此,该测序结果表明本研究中 MSP 法分析
