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1、1HHV6 和 HHV7 感染与类风湿性关节炎的相关性作者：王笑峰 孙迎娟 罗兵 李慧 王云【关键词】 HHV6摘要 目的 探讨人疱疹病毒 6 型(HHV6)和 7 型（HHV7）感染在类风湿性关节炎（RA）病因学中作用。方法 用巢式 PCR 技术，检测 62 例类风湿性关节炎病人和 138 例健康献血员外周血单个核细胞（PBMCs）和血浆中 HHV6 和 HHV7 DNA。结果 类风湿性关节炎病人组 PBMCs 中 HHV6 和 HHV7 DNA 阳性率与正常对照组比较均无显著性差异（P0.05） ；部分类风湿性关节炎病人血浆中可检出 HHV6 和 HHV7 DNA，而对照组血浆中则为阴性。
2、结论 类风湿性关节炎病人中可能存在 HHV6 或 HHV7 的活动性感染，与类风湿性关节炎的发生发展有一定关系。 关键词 关节炎，类风湿; 疱疹病毒 6 型，人; 疱疹病毒 7 型，人; 巢式聚合酶链反应RELATIONSHIP BETWEEN HHV6 AND HHV7 INFECTION 2AND RHEUMATOID ARTHRITISWANG XIAOFENG, SUN YINGJUAN, LUO BING, et al (Department of Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, Ch
3、ina) ABSTRACTObjectiveTo investigate the role of human herpesvirus 6 and 7 （HHV6, HHV7） infection in the etiology of rheumatoid arthritis （RA）.MethodsHHV6 and HHV7 DNA from the plasma and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were tested with nested PCR in 62 RA patients and 138 matched healthy
4、 adult donors. ResultsThe differences of positive rates of HHV6 DNA and HHV7 DNA in PBMCs of the patients were not significant compared with those of the healthy controls (P0.05); HHV6 and HHV7 & DNA were detected in the plasma of some patients but negative in the plasma of the controls.ConclusionHH
5、V6 and HHV7 DNA are present in the plasma of some RA patients, which suggests that the active infection of HHV6 and HHV7 may be related to the pathogenesis of RA. KEY WORDSrheumatoid arthritis; human herpsvirus 6; human herpsvirus 7; nested polymerase chain reaction3人疱疹病毒 6 型和 7 型（HHV6 和 HHV7）是新近发现的
6、对 T淋巴细胞具有高度亲嗜性的新型疱疹病毒，人群中感染十分普遍。原发感染多见于 6 月 2 岁婴幼儿，原发感染后通常以潜伏形式长期存在于宿主体内，在人体免疫力下降或免疫抑制状态下可被激活，导致活动性感染。国内外学者对该病毒与人体免疫功能的相互关系给予了极大关注。类风湿性关节炎（RA）是一种原因不明的自身免疫性疾病，通常认为是由多种因素诱发人体自身免疫反应而致病。有资料表明，某些病毒感染可促进人体自身免疫反应而成为自身免疫性疾病的诱发因素，但有关 HHV6 和 HHV7 感染与自身免疫性疾病关系的研究报道不多。本文以 RA 病人和健康人为研究对象，用巢式 PCR 检测其外周血细胞单个核细胞（PB
7、MCs）和血浆中HHV6 和 HHV7 DNA，进一步探讨 HHV6 和 HHV7 感染与 RA的相关性。1 材料与方法1.1 对象RA 病人 62 例，为 2002 年 10 月2002 年 12 月在青岛大学医学院附属医院内科、骨科和风湿免疫科门诊就诊及住院病人，均符合 1992 年美国心脏病协会修订的 Jones 标准。其中男 12 例，女428 例；年龄 1062 岁，平均（34.2314.70）岁。同期选择性别和年龄与之相应的青岛市中心血站健康献血员 138 例作为对照。1.2 方法1.2.1 标本处理 抽取受试者静脉血 4 mL, ACD 无菌抗凝， 1 200 r/min 离心
8、10 min，吸取中间白膜层 ,酚氯仿异戊醇法常规提取外周血细胞 DNA，同时分离血浆置-20 保存备用。1.2.2 血浆 PCR 模板制备 50 L 血浆加 50 L 裂解液，煮沸 5 min，以 8 000 r/min 离心 5 min，取上清作为 PCR 反应模板。1.2.3 PBMCs 中 HHV6 和 HHV7 DNA 的检测采用巢式 PCR 方法。PCR 引物设计及巢式 PCR 反应条件均参照文献 1 ，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物序列见表 1。同时设立阳性对照和阴性对照，HHV6 阳性对照为 HHV6 标 表 1 巢式 PCR 引物序列（略）取 PCR 产物 10
9、 L，20 g/L 琼脂糖凝胶（含 0.5 mg/L EtBr）中电泳，80 V、1 h，紫外线透射仪下观察结果。HHV6 外侧 PCR扩增产物为 287 bp，内侧 PCR 扩增产物为 163 bp；HHV7 外侧5PCR 扩增产物为 186 bp，内侧 PCR 扩增产物为 124 bp。1.2.4 限制性酶切分析 取 HHV6、HHV7 内侧 PCR 阳性扩增产物分别用 Hind和 EcoR进行限制性内切酶分析。酶切产物于120 g/L 聚丙烯酰胺凝胶中电泳，80V、90 min，凝胶用 EtBr（0.5 mg/L）染色 20 min。紫外线透射仪下观察结果。1.3 统计学分析采用 SPS
10、S 四格表卡方检验。2 结 果2.1 HHV6 DNA 检测 RA 病人 PBMCs 中有 34 例 HHV6 DNA阳性，阳性率为 54.84%；对照组 PBMCs 中有 73 例 HHV6 DNA阳性，阳性率为 52.90%（见图 1） 。两组 HHV6 DNA 阳性检出率差异无显著意义（2=0.002，P0.05） 。34 例 PBMCs HHV6阳性 RA 病人血浆中 23 例检测出 HHV6 DNA ，阳性率为37.10%，而对照组血浆中未发现 HHV6 DNA 阳性者。2.2 HHV7 DNA 检测6RA 病人 PBMCs 中有 38 例 HHV7 DNA 阳性，阳性率为 61.2
11、9%；对照组 PBMCs 中有 80 例 HHV6 DNA 阳性，阳性率为57.97%（见图 1） 。两组 HHV7 DNA 阳性检出率差异无显著意义图 1 部分标本 PBMCs 中 HHV6、HHV7 DNA 内侧 PCR 检测结果2.3 PCR 产物的限制性酶切分析 HHV6 内侧 PCR 阳性扩增产物（163 bp） ，经限制性核酸内切酶 Hind 酶切后可观察到两种情况，HHV6A 酶切产物为 66 bp和 97 bp 两条带，而 HHV6B 不被消化仍为 163 bp 的内侧 PCR扩增条带。RA 病人组 34 例 HHV6 阳性者中，有 30 例病人为HHV6B 型（88.24%
12、） ，有 4 例为 HHV6A 型（11.76% ） ；73 例HHV6 阳性正常对照者中 HHV6A 型占 17.81%（13/73） ，HHV6B型占 82.19%（60/73） 。RA 病人组与正常对照组 HHV7 内侧 PCR阳性扩增产物（124 bp）经限制性内切酶 EcoR消化后均出现 79 bp 和 54 bp 两条带，证明为特异性扩增条带。3 讨 论HHV6 和 HHV7 是两种普遍存在的人类疱疹病毒，均属 疱疹病毒亚科，具有高度的 T 淋巴细胞亲嗜性，而且两者具有较高的同7源性。HHV6 和 HHV7 原发感染后在人体内长期存在，具有潜伏活动的生物学特征。根据 HHV6 分离
13、毒株抗原性、感染宿主范围、限制性酶切图谱及其序列分析，将 HHV6 分为两组 ,即人疱疹病毒 6 型组和 B 组。HHV6 的原发感染主要为 HHV6B 感染。有研究提示，HHV6 和 HHV7 与自身免疫性疾病的发生有一定关系，其中 CD4分子是 HHV6 和 HHV7 重要的受体，SECCHIERO 等6 研究显示，HHV7 感染 CD4+细胞后，能引起 CD4 分子下调。HHV6、HHV7 与其他病毒如 EBV 和 HCMV 1 期王笑峰,孙迎娟,罗兵，等 HHV6 和 HHV7 感染与类风湿性关节炎的相关性 55 可共同导致宿主复合感染、B 淋巴细胞多克隆激活，机体免疫功能异常。近年来
14、的研究显示，器官移植和免疫抑制病人 HHV6 和 HHV7 检出率明显高于正常人，表明免疫抑制的病人非常容易感染 HHV6 和HHV7 或导致潜伏的病毒激活，HHV6 和 HHV7 的激活又可加重这些疾病的进程3 。RA 是一种全身性 T 细胞构成和功能紊乱导致的以关节滑膜损伤为主要表现的自身免疫性疾病，其诱因是多方面的。大量研究资料表明，RA 与病毒感染有关，EBV 感染是 RA 始动因子，与类风湿沉淀素的产生直接相关，而 HHV6、HHV7 感染则可反式激活 EBV。细胞因子在 RA 的发病机制中亦发挥着重要的作用，RA 病人的血清及关节液中可检测出高水平的 IL1 和TNF，IL1 是一
15、种促炎细胞因子，尤其是 IL1 为 RA 关节软骨破坏最重要的一种细胞因子。TNF 主要由单核巨噬细胞产生，YOCCUM 等4认为在 RA 活动期或进展期， TNF 呈高水平分泌，8导致一系列临床症状及局部关节组织的破坏，慢性期 TNF 水平相对较低且稳定。SAXNE 等5认为血清中 TNF 升高可能提示疾病的活动性或严重性， TNF 与 IL1 被称为“姊妹细胞因子” ，共同起到“中心罪犯”的作用。此外，IL1 和 TNF 尚能诱导致炎细胞因子 IL6 和 IL8 的产生， 在 RA 发病中共同发挥作用。已有研究证实，HHV6 感染可导致 PBMC 合成 IL2 降低，诱导细胞因子 IL1和
16、 TNF 的产生，表明 HHV6 感染在自身免疫疾病中可直接发挥作用。研究证实，健康人 PBMC 中可检测到 HHV6 和 HHV7 DNA，且 HHV6 和 HHV7 潜伏感染状态可被某些影响因素激活，从潜伏感染病人 PBMC 中可检出低水平的 HHV6 和 HHV7 DNA6 。 本研究以 RA 病人以及健康献血员为研究对象，采用巢式 PCR 技术检测 PBMC 中 HHV6 和 HHV7 DNA,提高了检测的敏感性和特异性，结果显示，病人组与对照组 HHV6 和 HHV7 阳性率无显著性差异，提示 HHV6 和 HHV7 感染与 RA 无明显相关性，与 COOKE 等7的研究结果相同。病人体内是否存在 HHV6 和 HHV7 的复发性激活，疾病的发生发展是否与 HHV6 和 HHV7 再激活有关，须确定 HHV6 和 HHV7 活动性感染检测指标。SECCHIERO 等8 研究表明，血浆、血清和
