微生物学实验八 微生物数量及大小测定

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1、实验八 微生物数量及大小测定13 生物基地 201300140059 刘洋 2014-11-23同组者：吕赞 刘沛余 马华峥一、 实验器材1. 菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)斜面培养物；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)液体培养基培养物2. 仪器和其他用品酒精灯，载玻片，盖玻片，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，计数器，镊子，显微镜，接种环，滴管，无菌水等3. 试剂草酸铵结晶紫染液二、 实验目的1. 巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。2. 学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包

2、括目镜测微尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。3. 了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点样、菌数计数的方法与计算。三、 实验原理1. 微生物大小测定原理微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺（图 1）目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把 5mm 长度刻成 50 等分，或把 10 mm 长度刻成 100 等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同

3、目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。图 1 目镜测微尺 图 2 镜台测微尺镜台测微尺（图 2）镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将 lmm 等分为 100 格，每格长 l0m（即 0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大

4、小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。2. 血球计数板测定微生物数量的原理镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有 4 条槽而构成 3 个平台。中

5、间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图 3)。每个方格网共分 9 大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为 16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由 400 个小方格组成(图 4)。每个大方格边长为 1mm，则每一大方格的面积为 1mm2，每个小方格的面积为1400mm 2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为 0.1mm，所以每个计数室(大方格

6、)的体积为 0.1mm3，每个小方格的体积为 l4000mm 3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。图 3 血球计数扳的构造a. 平面图 (中间平台分为两半，各半边有一个方格网)b. 侧面图 (中间平台与盖玻片之间有高度为 0.1 毫米的间隙) 图 4 血球计数板计数网的分区和分格四、 实验步骤1 目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺

7、的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长 l0m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。目 镜测 微尺每格 长 度（ ） =两重合线间镜台测微尺的格数 10两重合 线间 目 镜测 微尺的格数用此法分别校正在物镜倍数为 10，40，100下目镜测微尺每小格所代表的长度。2 细胞大小的测定A. 酵母菌的大小测定1) 取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。2) 移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量

8、酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。B. 枯草芽孢杆菌的大小测定1) 将载玻片洗净晾干后，在其中央滴一滴蒸馏水，然后通过无菌操作用接种针取少量枯草芽孢杆菌的斜面培养物于蒸馏水中，然后干燥2) 用结晶紫染液（或美兰染液）对其进行单染色，染色一定时间后冲洗载玻片的背面，将染液冲洗掉置于显微镜下镜检，用目镜测微尺测量枯草芽孢杆菌的长和宽。3. 酵母菌菌悬液中酵母菌菌数的测定1) 取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。2) 将酵母菌菌悬液充分摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的右

9、上角滴入一小滴(不宜过多)，使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。3) 先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。4) 计数时用 16 中格的计数板，要按对角线方位，取左上、左下、右上、右下的 4 个中格(即 100 小格)的酵母菌数。如果是 25 中格计数板。除数上述四格外，还需数中央 1 中格的酵母菌数(即 80 小格)。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。5) 凡酵母菌的芽体达

10、到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复分数 2-3 次(每次数值不应招差过大，否则应重新操作)，取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵母菌细胞数（25 中格）。菌液菌数 =525104 (： 5个方格菌数和 ：稀 释 倍数 )五、 注意事项1. 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。2. 测量菌体大小时要在同一个标本片上测定 3 个大小相近的菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是

11、用对数生长期的菌体进行测定。3. 血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，可以用去污粉洗净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干。六、 实验结果目镜测微尺的标定结果物镜倍数（目镜均为 10 倍）目镜测微尺的格数（小格）镜台测微尺的格数（大格）目镜测微尺的每格的长度（m）10 倍 10 10 1040 倍 29 7 2.41100 倍 92 9 0.97菌种大小测定结果菌种 物镜倍数 大小枯草芽孢杆菌 100 倍 长宽=1.94m0.97m酵母菌 40 倍 直径=7.23m血细胞计数板对酵母菌悬液计数结果方位 左上 右上 左下 右下第一次 2（出芽） 2+2（出芽

12、） 2 2第二次 2 4 4 5第三次 3 3 3 1第四次 2 4 2+2（出芽） 6第五次 4 3 5 1总平均值 2.52108 个/ml出芽率 5%七、 思考题1.为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜台微尺重新对目镜测微尺进行校正？答：因为目镜测微尺每格代表的长度与物镜倍数不是成比例的增加。 2.在不改变目镜和物镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一株细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？答：相同。因为改变物镜放大倍数后，只要经校正计算出正确的目镜测微尺每格代表的长度，再进行测量，经计算都会得到菌的实际大小。3.根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差力求准确？答：样品的浓度要适中，太浓则不易计数， 太稀也会导致计数不准确。另外稀释时要精确。样品稀释后要摇匀，否则计数板每个格内的细菌数菌量分布不均，会造成较大误差。4.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计 12 种可行的检测方法。答：将干酵母粉制成酵母菌液，取少量菌液于试管内并加入少量美蓝染液进行混合，然后在血球计数板进行观察计数，算出所有死活菌的总数量，然后观察计数变蓝的死的菌量，两者比就是干酵母粉中的活菌存活率。