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1、药理实验设计与临床毒理学方法,1,药理实验设计与临床毒理学方法 安徽医科大学临床药理研究所,药理实验设计与临床毒理学方法,2,药理实验设计及统计分析,药理实验设计与临床毒理学方法,3,药理实验设计的基本要求,重复原则：包括重现性、重复数 药理实验应尽量减少干扰因素对实验的影响，严格按照GLP、GCP相关要求开展研究工作。 随机原则 完全随机 均衡随机 对照原则 阴性（空白）对照、安慰剂对照 阳性（标准）对照 自体对照与组间对照等 客观性原则 实验设计时要力戒主观偏性干扰，选择观察指标时，不用或尽量少用带主观成分的指标。,药理实验设计与临床毒理学方法,4,实验设计方法,单组比较设计：在同一个体上
2、观察实验处理前后某种观测指标的变化。 配对比较设计：实验前将性别、体重或其他相关因素加以配对，以基本相同的两个个体为一对，配成若干对，然后分别将每对个体随机分配于两组中。 随机区组设计：为配对设计的扩大 完全随机设计：用随机数字表等方法完全随机化分组。 交差实验设计： 正交实验设计：研究多因素试验的一种设计方法，适用于多因素、多水平、试验误差大、周期长的一类试验的设计。 拉丁方设计,药理实验设计与临床毒理学方法,5,随机数字法分组,动 物 编 号 随机编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 随机数字 8 6 4 7 10 13 7 7 6 2 11 4 2
3、 12 9 除以3的余数 2 0 1 1 1 2 1 1 0 2 2 1 2 0 0 初步分组 c a b b b c b b a c c b c a a 表中b组为6只，a组为4只，需再调整，再抄写下一数字，将其数字除以6得余数为几即挑第几只放入第三组。,药理实验设计与临床毒理学方法,6,正交设计方法（举例）,L4（23）正交设计表,药理实验设计与临床毒理学方法,7,预试与筛选,预试 充分重视预试的重要性，目的在于检查各项准备工作是否完善，实验方法和步骤是否切实可行，测试指标是否可靠，初步了解实验结果与预期结果的距离，从而为正式实验提供补充、修正的意见和经验，提高实验的重复稳定性和灵敏度。但
4、是，预试验的结果不能归入正式试验的最后结果一同分析。 筛选 筛选是在预试或既往经验的基础上，用少量动物对多数药物进行实验。包括保护实验和概率判别实验。,药理实验设计与临床毒理学方法,8,药理实验设计中的样本问题（一）,实验动物的基本例数 小动物（小鼠、大鼠、鱼、蛙等）每组1030例：计量资料每组不少于10例，计数资料每组不少于30例； 中等动物（豚鼠、家兔）每组820例：计量资料每组不少于8例，计数资料每组不少于20例； 大动物（犬、猫、猪、羊）每组620例：每组不少于6例，计数资料每组不少于20例；,药理实验设计与临床毒理学方法,9,药理实验设计中的样本问题（二）,临床药效比较的基本例数 公
5、认难以治愈的疾病（cancer、狂犬病等）：510例； 危急严重的疾病（休克、心力衰竭、流行性脑脊膜炎等）：3050例即可 一般慢性疾病（哮喘、冠心病、流行性感冒等）：计数资料需100500例 临床实验基本例数意见不一，不同疾病不同药物有时出入很大，出具结论应慎重。,药理实验设计与临床毒理学方法,10,药理实验设计中的样本问题（三）,按统计学方法测算样本数 （1）配对试验样本数的确定 n=(t0.05sd)2/d2 其中：sd为前人试验或经验所得各组间差异的方差 d为要求达到所预期的差异显著时的均数差值 t0.05为一定的df下，=0.05的T值 首次估计将用n30，t=2代入 （2）非配对试
6、验动物样本数的确定 n=(t0.052（s1+s2)/（x1-x2）2 其中： s1、s2为试验或经验所得的两组的样本标准差 x1-x2为要求达到所预期的差异显著时的均数差值 t0.05为一定的df下，=0.05的T值 首次估计将用n30，t=2代入,药理实验设计与临床毒理学方法,11,药理毒理学研究中的剂量问题,最适剂量的探索 进行药效对比时一般选用中效剂量，进行解毒或拮抗实验时剂量可略高一些，协同实验宜略低一些； 探索最适剂量时，应由小量开始。一般而言，离体器官上按3倍或10倍递增，整体实验按2倍或3.16倍递增； 已知高低剂量时，中剂量可选用其算术平均值,药理实验设计与临床毒理学方法,1
7、2,药理毒理学研究中的剂量问题,安全剂量的探索 由动物实验中该药与已知药物的效价比值推算； 应用不同动物间的剂量换算公式计算等效剂量，一般取最大耐受量的1/3作为较安全的试用量； 剂量递增方案 应用“开始试用量（ds）”后，如未出现疗效，也未出现不良反应，可按下述方案递增： 动物实验：按ds、2ds、3.3ds，24次可达到预期量，以后每次递增3040%； 人体实验：用预试量的1/51/10为开始试用量，按ds、2ds、3.3ds、5ds、7ds、9ds递增，4-6次可达预期量，以后每次递增2530%。,药理实验设计与临床毒理学方法,13,同种动物间等效剂量的换算,一般动物的用药剂量均以mg/
8、kg表示，另一些实验用mg/m2表示更为合理，实验误差可以明显减小。 体表面积近似计算方法： lg S =0.8762+0.698lgW W为动物体重（克）， S为体表面积（厘米2） A=RW2/3 A为体表面积（m2），W是体重（kg），R是体型系数 不同动物的体型系数（R） 同种动物间剂量折算方法：D1:D2=A1:A2=(W1:W2) 2/3,药理实验设计与临床毒理学方法,14,标准动物间的等效剂量折算 DAkDB DA为A种动物的剂量（mg/只），DB为B种动物的剂量（mg/只） 不同动物等效剂量（mg/只）的折算系数（k）,药理实验设计与临床毒理学方法,15,不同动物间的剂量换算公式
9、,动物的种属不同、年龄不同其给药剂量不同。 dB=dARB/RA(WA/WB)1/3 dA、dB是A、B两种动物的每kg体重剂量（mg/kg） RA、RB是动物体型系数。R与表面积（m2）/体重的1/3次方成正比。 不同种属的动物体型指数（R）,药理实验设计与临床毒理学方法,16,不同动物与人的等效剂量比值,剂量按mg/kg算，人体重以70kg计,药理实验设计与临床毒理学方法,17,不同给药途径间的剂量换算,不同给药途径之间的剂量换算与药物的绝对生物利用度有关。 以口服量为100时，皮下注射量为3050，肌肉注射量为2030，静脉注射量为25。 给药剂量可参照经验，但最好亲自实验。因为每种药物
10、的生物利用度是不一样的。简表中所示只是一种多数情况下的估计，可能与实际会有较大出入。 能够不改给药途径时，尽量不改。尤其是口服和静注之间有时按上述折算给药时，血药浓度相差太大，主要是口服影响因素多。 有时实验操作熟悉程度影响很大，尤其是静注。 不同给药途径间的剂量换算估值简表,药理实验设计与临床毒理学方法,18,临床前毒理学实验方法,药物毒理学的研究目的： 认识并发现药物的毒性作用，为临床安全用药提供科学依据； 确定药物毒作用的靶器官； 确定毒作用的剂量范围； 了解药物的毒作用是否具有可逆性； 研究药物中毒后的解毒及其解救措施； 阐明药物的毒作用机制，为申报新药提供毒理学资料。,药理实验设计与
11、临床毒理学方法,19,临床前药物毒理学研究的内容,一般毒理学实验：包括急性毒性试验、长期毒性试验、毒代动力学试验和生物技术产品的安全性评价试验研究。 特殊毒性实验：包括遗传试验、生殖毒性试验和致癌性实验等。 其它毒性实验：包括局部毒性试验、安全药理学试验、药物依赖性试验和免疫毒性试验研究等。,药理实验设计与临床毒理学方法,20,毒理学试验的基本要求,GLPgood laboratory practice 受试物的化学特性与杂质 充分了解受试物的理化特性，有利于正确选择给药途径、确定储存条件、进行实验设计，慎重选择合适的溶剂、助溶剂或赋形剂 水溶液蒸馏水或生理盐水 混悬液研钵中研细，逐步加入少量
12、助悬剂反复研磨最后形成一定比例，搅拌均匀，多用0.5%CMC-Na 油剂植物油或有关矿物油 稀盐酸溶液1-10%稀盐酸 有机溶剂先用有机溶剂溶解，再用水稀释，如稀释后溶解度降低，可加少量助溶剂如吐温、司本（span）等 乳剂油脂类或树脂类物质，借乳化剂的作用或机械研磨、搅拌成乳化水制剂 实验动物及实验条件 观察指标：饮食、饮水情况、体重、异常反应（包括死亡）、生理生化指标、脏器解剖、病理改变等 结果的分析和评价,药理实验设计与临床毒理学方法,21,急性毒性试验,经口给药的急性毒性试验 （1）多采用大鼠、小鼠 （2）LD50 （3）MTD （4）限度实验（limit tests) 小鼠急性毒性实
13、验口服剂量大于5g/kg，注射剂量大于2g/kg，未产生明显毒性，可考虑只做一个高于临床拟用剂量50倍（犬用30倍）的剂量组。 急性皮肤毒性试验 （1）多采用大鼠、兔、豚鼠等 （2）要求使用制剂 （3）应保证受试物与皮肤局部的良好接触 急性吸入性毒性试验 （1）多采用成年大鼠 （2）暴露浓度的设计应足以反应量效关系，至少3组 （3）暴露时间应在受试空间浓度达到平衡后至少4h （4）若一次暴露浓度为5mg/L（实际吸入的浓度）达到4h，或受试物的最高浓度未致使动物死亡，则无需设置3个浓度。,药理实验设计与临床毒理学方法,22,一般采用两种给药途径给药，其中一种必须是临床给药途径。 给药剂量和分组
14、：预试验测出死亡率接近0%和100%的剂量范围，在此范围内一般设46个剂量组，相邻组间剂量比通常取1:0.71:0.85，尽可能使一半组数的动物死亡率大于50%，另一半小于50%。 结果处理 改进寇氏法：m=Xm-I(p -0.5) Sm=I(p- p2)/n-11/2 m的95%可信限=m1.96Sm m为LD50的对数值，Xm为最高剂量的对数，I为相邻两剂量组对数剂量之差，p为各组动物死亡率，p为各组死亡率的总和，Sm为标准误，n为每组动物数 Bliss软件法:,LD50的测定试验的剂量设置,药理实验设计与临床毒理学方法,23,最大耐受量（MTD）试验的剂量设置,药物以最大允许浓度和动物能
15、耐受的最大容积一次或24小时内多次给药，观察714d，如动物不出现死亡，则认为该药对某种动物某种给药途径的MTD为某一数值，如有个别动物死亡，则认为该药的MTD大于某一数值 (剂量一般不超过5g/kg 体重)。 一般说来最大给药浓度和容积与药物的理化性质、给药途径、动物品种及饥饿状态有关。静脉给药时，除考虑药物溶解度、给药容积等因素外，还应注意药物的PH值及渗透压的影响，并注意控制注射速度。 急性毒性实验常用动物最大给药容积,药理实验设计与临床毒理学方法,24,全身主动过敏试验（ASA）及剂量设置,首选豚鼠，进行何种过敏性研究应根据药物自身特点（如化学结构等）、其他药理毒理的实验结果，特别是长
16、期毒性试验的结果、临床适应症及给药方式等确定。 设立阴性、阳性对照组和受试物不同剂量组。阴性对照组应给予同体积的溶媒，阳性对照组给予1-5mg/只牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏阳性物质，受试物低剂量组给予临床最大剂量（/kg或m2），受试物高剂量组给予低剂量的数倍量。每组动物数至少6 只。 剂量设计应合理，建议选择多个剂量以进行剂量与过敏反应的量效关系研究，争取找出无过敏反应的剂量；避免因剂量过低而导致假阴性结果的出现；帮助判断阳性结果是否因强刺激反应引起。应设立阳性和阴性对照组。,药理实验设计与临床毒理学方法,25,皮肤刺激性试验及剂量设置,首选家兔，每组动物数48 只，一般雌、雄各半，采用同体左右侧自身对比法，取受试物0.5 ml 直接涂布贴敷时间至少4 小时，贴敷结束后，除去受试物并用温水或无刺激性溶剂清洁给药部位。多次给药皮肤刺激性试验应连续在同一部位给药，每次给药时间相同，贴敷期限一般不超过4 周。观察并记录涂敷部位有无红斑和水肿等情况。 在给药面积不变的情况下，不应通过增加厚度来满足增加给药量的目的。,药理实验设计与临床毒理学方法,26,注射给药部位刺激性试验及剂量设置,
