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1、12基因工程的基本操作程序1获取目的基因的常用方法有：从基因文库中获取目的基因和利用PCR 技术扩增目的基因。 2基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。3一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。4将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。5培育转基因动物时，受体细胞一般是受精卵，目的基因的导入方法常用显微注射技术。6检测目的基因是否导入和转录，常用分子杂交技术；检测是否翻译，常用抗原抗体杂交技术。目的基因的获取自读教材夯基础1目的基因(1)主要是指编码蛋白质的基因。(2)也可以是一些具有调控作用的因子。 2
2、获取方法(1)从基因文库中获取：基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。(2)利用PCR 技术扩增目的基因：原理：DNA 复制。前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。条件：DNA 模板、引物、热稳定DNA 聚合酶和 4 种脱氧核苷酸。扩增过程：模板DNA 受热解旋为单链：冷却后，引物结合到互补DNA 链上：在热稳定DNA 聚合酶作用下，从引物起始进行互补链的合成(3)1探讨基因文库、基因组文库、cDNA 文库之间的关系。提示：基因组文库含有一种生物的全部基因，而 cDNA 文库只含有
3、一种生物的部分基因，二者都是基因文库。2从酶的角度分析PCR 技术扩增DNA 与DNA 体内复制的不同点。提示：PCR 技术扩增DNA 不需要解旋酶；PCR 技术需要的DNA 聚合酶应具有热稳定性。基因文库的构建供体细胞中的DNA限制酶许多DNA片段过连接表达载体程导入目的基因的mRNA 反转录单链DNA合成双链DNA插入载体导入受体菌群(cDNA 文库)分离目的基因DNA高温解链单链DNA受体细胞外源DNA扩增，产生特定性状与引物结合、 聚合酶大量目的基因蛋白质的氨基酸序列推测 mRNA 的核苷酸序列推测基因的核苷酸序列化学合成目的基因1 提取目的基因方法的比较跟随名师解疑难方部分基因文PC
4、R 技术扩增人工合成法基因组文库库(如 cDNA文库)分离目的基因目的基因专一性强，可产优可在短时间内大操作简单专一性强生自然界中不存点量扩增目的基因在的新基因缺工作量大、盲目性 操作过程较麻烦，技术要 需要严格控制温适用范围小点大、专一性差求过高度，技术要求高DNA 复制PCR 技术解旋方式解旋酶催化DNA 在高温作用下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在PCR 扩增仪内)区别酶DNA 解旋酶、普通的DNA 聚合酶等 耐热的DNA 聚合酶(Taq聚合酶)温度条件细胞内温和条件需控制温度，在较高温度下进行合成的对象DNA 分子DNA 片段或基因模板：均需要脱氧核苷酸链作为模板进行
5、物质合成原料：均为四种脱氧核苷酸联系酶：均需要DNA 聚合酶进行催化引物：均需要引物，使 DNA 聚合酶从引物的 3端开始连接脱氧核苷酸2PCR 技术与生物体内DNA 复制的比较特别提醒(1)基因工程操作中，只有使用受体生物自身基因的启动子才比较有利于基因的表达。 (2)通过 cDNA 文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞中无法转录。(3)热稳定DNA 聚合酶(Taq 聚合酶)能在高温下保持其活性，是PCR 技术关键的工具之一。基因表达载体的构建和目的基因的导入1基因表达载体的构建自读教材夯基础(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传和表达。(2)组成：2将目
6、的基因导入受体细胞 (1)导入植物细胞的方法：原理：农杆菌Ti质粒上的T-DNA可整合到农杆菌 转化法受体细胞的染色体DNA上适用范围：主要适用于双子叶植物和裸子植物基因枪法：常用于单子叶植物。花粉管通道法：目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。(2)导入动物细胞：方法：显微注射技术。常用受体细胞：受精卵。(3)导入微生物细胞：原核生物特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。方法：感受态细胞法，即用Ca2处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。1思考基因表达载体的构建需要哪些工具酶。提示：限制酶、DNA 连接酶。2结合教材P13 资料卡分析，
7、用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。提示：需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。3为什么动物的体细胞不能作为受体细胞？提示：动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。跟随名师解疑难1基因表达载体的构建过程将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量 DNA 连接酶，形成一个重组DNA 分子(重组质粒)。构建过程如图所示：2将目的基因导入受体细胞的方法比较受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将
8、目的基因插入Ti 质粒的 T-DNA 上转入农杆菌中导入植物细胞整合到受体细胞的DNA上提纯含目的基因的表达载体显微注射受精卵发育具有新性状的个体Ca2处理细胞感受态细胞基因表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA 分子特别提醒(1)完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶，连接产物有目的基因目的基因，目的基因运载体和运载体运载体三种。2(2)将基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌的常用方法是 Ca2处理法。Ca2(或 CaCl 溶液)对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。目的基因的检测与鉴定1分子水平的检测(连线)自读教材夯基础2个体水平的鉴定(1)抗虫或抗病的接种
9、实验。(2)对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较。1检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。2DNA 分子杂交的原理是什么？有哪些应用？提示：碱基互补配对原则。可用于亲子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关系确定等。跟随名师解疑难目的基因的检测与鉴定归纳目的基因的获取方法例 1为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。据图回答：(1)图中基因组文库 (填“小于”“等于”或“大于”)cDNA 文库。(2)B 过程需要的酶是 ；A、C 过程中 (填“可以”或“不可以”)使用同
10、一种探针筛选含目的基因的菌株。(3)目的基因和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中 和 为模板直接进行 PCR 扩增，该过程中所用酶的显著特点是 。思路点拨精讲精析 分析获取植酸酶基因的流程图可知，图中基因组文库大于cDNA 文库。B过程需要的酶应该是逆转录酶；A、C 过程虽然都能获得含目的基因的菌株，但C 中无内含子对应的序列，所以不可以使用同一种探针进行筛选。目的基因和除可从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中 DNA 和 cDNA 为模板直接进行 PCR 扩增，该过程中所用酶的显著特点是耐高温。答案(1)大于(2)逆转录酶 不可以(3)DNAcDNA耐高温归纳拓展 真核细胞基因
11、结构(1)结构编码区：内含子、外显子 非编码区：启动子、终止子(2)表达：只有编码区能转录生成RNA，且内含子转录的部分要剪切掉，即转录生成的 mRNA 只有外显子对应部分。因此，以mRNA 为模板，逆转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。下列关于cDNA 文库和基因组文库的说法中，不正确的是() AcDNA 文库中的DNA 来源于mRNA 的反转录过程B如果某种生物的 cDNA 文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同CcDNA 文库中的基因都没有启动子D一种生物的cDNA 文库可以有许多种，但基因组文库只有一种解析：由于基因转录
12、时只有编码区段才能转录，所以以 mRNA 反转录成的 DNA 就只有外显子区段，而缺少内含子和启动子等非编码区段，和原来的基因结构不相同。答案：B基因表达载体的构建例 2 右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶 EcoR、BamH的酶切位点，ampr 为青霉素抗性基因，tetr 为四环素抗性基因，P 为启动子，T 为终止子，ori 为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括 EcoR、BamH在内的多种酶的酶切位点。据图回答：(1)将含有目的基因的DNA 与质粒分别用 EcoR酶切，酶切产物用 DNA 连接酶进行连接后，其中由两个 DNA 片段之间连接形成的产物有 、 、
13、三种。(2)用上述 3 种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中， 能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有 ；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有 。(3)目的基因表达时， RNA 聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。思路点拨精讲精析(1)将含有目的基因的DNA 与质粒分别用 EcoR酶切，所产生的黏性末端相同，用DNA 连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3 种不同的连接物：目的基因目的基因、目的基因运载体、运载体运载体。(2)在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培养基上生长，只有运载体运载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。(3)启动子是RNA 聚合酶识别和结合的位点，可启动转录过程，合成mRNA。(4)由图示和题目中提供的信息可知，同时运用 EcoR和 BamH进行酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。答案(1)目的基因载体连接物 载体载体连接物 目的基因目的基因连接物(2)载体载体连接物 目的基因载体连接物、载体载体连接物(3)启动子 mRNA
