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1、质粒DNA的提取、纯化及验证姓名:肖风 学号:2 2010级生物工程一、【实验目的】1、 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用,掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。2 、掌握质粒DNA的纯化方法,即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。3 、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理,凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中,碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单,易于操作,一般实
2、验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。 碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中,染色体DNA以双螺旋结构存在,质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达120的碱性溶液中,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。当用pH值46的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋
3、结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白,可通过酚氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。2、琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳技术操作简单而迅速,分辨率高,分辨范围极广。此外,凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYB
4、R Gold染色直接观察到,甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话,这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收,用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中,常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径,也能以许多不同的构型和方位进行电泳。琼脂糖凝胶电泳易于操作,适用于核酸电泳,测定DNA的相对分子质量,分离经限制酶水解的DNA片段,进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。在溶液中,由于核酸有磷酸基而带负电荷,在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素:(1)样品DNA分子的大小:电泳时,线性
5、双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的,其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比,这是因为大分子有更大的摩擦阻力。(2)DNA分子的构象:相对分子质量相同而构象不同的DNA分子,其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中,由于各种因素的影响,使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的一条链断裂,变成开环DNA(open circle DNA,oeDNA)分子,如果两条链发生断裂,就转变为线状DNA(1iner DNA,L DNA)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下,超螺旋型迁移速度最快,其次为线状分子
6、,最慢的是开环状分子。(3)琼脂糖浓度:琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径,一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低,则凝胶孔径越大,DNA电泳迁移速度越快,因此,相对分子质量越大,选用的凝胶浓度应越低。(4)电泳所用电场:低电压条件下,线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比,电压越高,带电颗粒泳动越快,但随着电场强度的增加,不同长度DNA泳动的增加程度不同,因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果,电场强度应小于5 Vcm。(5)缓冲液:缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水(如不慎误用去离子水配制
7、凝胶),溶液的导电性很少,带电颗粒泳动很慢,DNA几乎不移动;而在高离子强度下(如错用10电泳缓冲液),导电性极高,带电颗粒泳动很快,产生大量的热,有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。 (6)温度:琼脂糖凝胶电泳时,不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在430内无变化,一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行,而当琼脂糖含量少于05时,凝胶很脆弱,最好在4下电泳以增加凝胶强度。三、【实验材料】恒温振荡培养箱,高速冷冻离心机,漩涡振荡仪,水浴锅;1.5mL离心管,50mL离心管,不同型号的吸头,微量移液器等。菌体:E.coli DH5受体菌,具有Ampr标记的质粒pUC19微波炉,电泳仪,制胶槽,电泳槽,梳子
8、,锥形瓶,电子天平,手套,紫外灯,Eppendorf管,刀片,塑料薄膜等。酶切后的DNA样品或其他待分离纯化的DNA样品;琼脂糖,TAE缓冲液,溴化乙锭(EB),6上样缓冲液,DNA相对分子质量标准物DNA Marker /Hind III,5 mol/L pH5.2的醋酸钠,无水乙醇。四、【实验步骤】(一)、实验前准备 1、LB培养液+1%葡萄糖按照附录所示配方配制LB培养液,并添加1%葡萄糖,115灭菌30min,分别分装于100mL锥形瓶中20mL,300mL锥形瓶中50mL;同时配制固体培养基用于活化菌株。2、枪尖:1000L(蓝色)、200L(黄色)、20L(白色),灭菌备用3、离心
9、管:1.5mL离心管于500mL锥形瓶中,50mL离心管2支,灭菌备用4、吸管:10mL吸管,灭菌备用(二 )、质粒提取1、细胞培养在含有氨苄青霉素的LB平板上挑去携带有质粒pUC19的E.coli 单菌落,接种于20mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37振荡培养过夜。将过夜培养液吸取23mL接种到50mL含有氨苄青霉素的LB培养基中,37培养46h,即到达菌体生长的对数晚期。 2、 质粒提取2.1. 取30mL菌液于50mL灭菌离心管中,在7000r/min条件下离心5min,弃去上清液,收集菌体细胞。空管质量为15.570g。2.2. 向离心管中加入5mL冰箱预冷的溶液,加入溶液I主要是
10、为了打散菌体,使菌体沉淀转变成为均匀的菌悬液,为下一步破碎菌体做准备,可剧烈振荡,此时细胞尚未破裂,不用担心染色体断裂。为节省时间,可在漩涡振荡仪上混匀。通过步骤(1)离心,弃去上清液,将离心管倒置,使上清液全部流尽,用吸水纸擦干,称量菌体质量,为15.742-15.570=0.172g。2.3. 按湿菌体质量:溶液I体积=100mg:1mL的比例加入用冰箱预冷的溶液I(2mL),剧烈振荡,使细菌完全分散,将离心管置于碎冰中冰浴5min2.4. 以2倍体积加入新配制的溶液(4mL),轻摇轻加,至半透明溶液形成。此步是DNA变性的关键步骤,加入溶液II后,菌悬液pH上升到12左右,为强碱性,破坏
11、大肠杆菌(G-)细胞壁,此时,溶液变粘稠、透明,无菌块残留,因为染色体DNA与质粒DNA均变性溶解于强碱溶液中,蛋白质也溶于溶液中,但质粒DNA双链不完全分离。因此步染色体DNA释放,故动作必须轻柔,不能剧烈震荡,否则染色体DNA会断裂成小片段,不形成沉淀,而溶解于溶液中,与质粒DNA混合在一起,不利于质粒DNA提纯。可缓慢上下颠倒离心管数次,既要使试剂与染色体DNA充分作用,又不破坏染色体的结构。2.5. 以1.5倍溶液I体积量加入冰箱预冷的溶液(3mL),轻加轻摇,慢慢颠倒数次,使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,然后将离心管置于冰上10min,此时有白色絮状沉淀物。此步是质粒DNA复性的关
12、键步骤。动作要轻柔,理由同上。同时可减少对质粒DNA的破坏,使其保持超螺旋闭环结构。2.6. 12000r/min离心15min,将上清液轻轻转移到另一洁净离心管中,向上清液中加入1/10体积的 3mol/mL 的NaAc和2倍体积的冰无水乙醇,混匀,-20下静置30min,沉淀DNA。2.7. 如(6)中离心15min,小心弃去上清液,将离心管倒置于纸巾上,以使所有的液体流出。2.8. 向沉淀物中加入70%乙醇3mL,不打散沉淀洗涤一遍。12000r/min离心5min,弃去上清液,将离心管倒置于纸巾上,室温干燥。2.9. 将DNA沉淀溶于1mLTE缓冲液中,加入RNase A(终浓度大于5
13、0g/mL)。37保温0.51h。3 质粒DNA的纯化 3.1. 将上述DNA溶液平分在2个1.5mL的微量离心管中,每管0.5mL,分别加入等体积的Tris饱和苯酚溶液,混匀,7000r/min离心5min,取上层清液到另一洁净微量离心管中。离心后,苯酚位于离心管的最下方,蛋白质层位于中间,溶解有质粒DNA的水层位于最上方。离心管从离心机里取出后,尽量减少晃动,以免蛋白层污染DNA水溶液,使分界面模糊、不清晰,不利于下一步分离。使用苯酚等有腐蚀性的有机溶剂时,一定要戴橡胶手套,注意安全。一旦皮肤被苯酚等污染,立即用大量水清洗。3.2. 加入等体积苯酚:氯仿(1:1)混合液,混匀,7000r/
14、min离心5min,取上层清液到另一洁净微量离心管中。3.3. 加入等体积氯仿溶液,混匀,7000r/min离心5min,取上层水相到另一洁净微量离心管中。3.4. 加入2倍体积的无水乙醇,1/10体积的3mol/L NaAc溶液,混合均匀,于-20沉淀0.5h以上。沉淀质粒DNA可采用无水乙醇,需在低温条件下静置。由于细胞裂解时同时释放出一些酶类,低温条件可保证DNA水解酶类保持在低活性,以减少其对DNA的降解。用70%的乙醇洗涤质粒DNA沉淀,主要目的是利用乙醇中的水分溶解残余盐类等杂质。在加入RNase A前洗涤去盐类,可保证酶活不受其影响。3.5. 12000r/min离心15min,
15、收集沉淀,弃去上清液并干燥。 3.6. 在沉淀DNA中,加入70%乙醇200L,不打散沉淀洗涤一次,12000r/min离心1min,小心弃去上清液,将离心管倒置于纸巾上使所有的液体流出,室温干燥。3.7. 用50L TE溶液重新溶解DNA,温和震荡几秒钟,备用。溶解沉淀时,为获得最大量产品,应逐滴加入溶剂,边加边摇;尽量少转动离心管,避免过多样品粘于壁上导致损失。4 DNA纯度检测(0.9%琼脂糖凝胶电泳法)4.1. 制板4.1.1. 称量0.36g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入40mL 1TAE缓冲液,在微波炉中加热,使琼脂糖融化。4.1.2. 待凝胶温度降至大约55以下(手持瓶子不烫手,即感
16、觉热但能握得住)。4.1.3. 在模具上插入一个合适的梳子形成加样孔(如果待回收的DNA体积较大时,可用透明胶带将几个相邻的梳齿封住,使之形成较大的孔)。梳齿的位置应在托盘底面上0.51.00mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。4.1.4. 将凝胶倒入准备好的制胶模具中,等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状(月30min),将梳子轻轻拔出。4.1.5. 用拇指和食指轻移胶版两侧,将凝胶体放入加有TAE缓冲液的电泳槽中,并且使电泳缓冲液高出凝胶表面。4.2. 电泳4.2.1. 取3L质粒样品+1L电泳载样液,在塑料薄膜上用微量移液管吹吸混匀,加入到凝胶孔中,枪尖应没入液面但在凝胶面上方正对点样孔处。吹洗法混匀少