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1、兽医生物技术实验手册动物医学院细胞生物学实验室自编手册2010.11目录一、 PCR技术及DNA凝胶电泳及PCR片段的纯化.1二、 DNA限制性酶切反应、DNA酶切片段的回收与鉴定.4三、 大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA连接转化7四、 质粒DNA的提取及鉴定.10五、 蛋白质的原核表达.13六、 蛋白质电泳.14注意事项实验注意事项：1 对所有样品进行严格标记，避免混淆2 酶及蛋白等样品一定要低温放置3 加样品时注意更换枪头，避免对试剂或样品的交叉污染4 接触DNA荧光嵌入染料等有害物品时一定要戴手套5 注意将反应样品混匀实验室仪器使用注意事项：1. 使用离心机时，一定要注意平衡。2. 注意
2、正确使用移液枪，设置量程时，禁止超过最大量程。细菌操作注意事项：中心原则：1. 保护操作人员不受细菌感染。2. 防止使用的细菌受到其它微生物（比如：真菌、其它细菌等）的污染。本实验课使用的大肠杆菌均是经过人工改造，供实验室研究用的菌株。和野生型的菌株相比，这些菌株的毒力明显减弱，但仍应视为有害物质。尤其是我们使用的许多大肠杆菌均转入了表达抗生素的质粒，因此严禁将这些大肠杆菌释放到环境中。注意事项：1. 在实验室里禁止吃喝，不要将笔、手指及其它任何物品放入口中。2. 如果不慎洒溅出了细菌液，需立即用纸将菌液吸干，并对细菌污染区域做消毒处理。3. 禁止用手直接接触菌液。4. 正确并及时标记所有培养
3、细菌的试管和培养皿。5. 拿细菌培养试管时，不要只拿盖子部分，因为盖子盖的不紧，试管部分容易脱落，造成细菌污染。6. 如手等部位有伤口，应将伤口部位包扎好。7. 细菌液必须经过消毒处理之后，才能倒掉。实验一、PCR技术、DNA凝胶电泳及PCR片段的纯化实验原理：聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是利用两已知序列的寡核苷酸作为上、下游引物,在耐热性DNA聚合酶(Taq酶)作用下将位于模板DNA上两引物间特定DNA片段进行一种指数级增长的复制过程。PCR反应体系由模板DNA、引物、耐热性DNA聚合酶、底物(四种dNTP)、缓冲液和Mg2+等组成。其操作过程为
4、变性、退火、延伸等三个步骤循环进行。其中变性是加热条件下模板DNA双链间的解离,退火是降低温度使模板DNA与高浓度引物间的互补结合,延伸是在耐热性DNA聚合酶和Mg2+等存在下扩增特定的DNA片段。每次循环扩增产物又可作为下一循环的模板,因此理论上每经过一轮变性、退火、延伸三个步骤,特定DNA片段的分子数目增加一倍。耐热性DNA聚合酶的应用使PCR循环反应可自动进行,提高了反应的特异性和效率。引物设计是PCR技术的关键步骤，直接影响扩增的效率和特异性。同时，通过适当改变引物的设计可实现多种PCR技术，现在利用计算机软件可辅助设计某一己知序列基因的特定引物。PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段
5、的分子生物学技术,具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在医学、分子生物学领域得到广泛应用，如应用于DNA克隆、突变分析、基因融合、基因半定量、遗传性疾病的诊断等方面。DNA凝胶电泳常用的是琼脂糖电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的重要方法，该技术操作简便快速。其原理与蛋白质电泳基本相同。在pH高于其pI时，DNA分子带负电荷，在直流电场中DNA向正极泳动。不同的DNA分子因所带电荷、构象和分子量大小不同，在同一电泳系统中的泳动速度存在差异，因而可以使核酸片段彼此分离，并检测其分子大小。电泳后的凝胶浸泡于荧光染料（如溴化乙锭Ethidium bromide 或
6、Goldview）中，染料分子可嵌入DNA分子碱基之间，在紫外线照射下发出荧光，可观察到核酸片段所在的位置和亮度，从而对DNA进行定性或定量测定。琼脂糖凝胶的浓度可根据DNA分子的大小来确定，一般基因组DNA可用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，质粒DNA选择1琼脂糖凝胶，而对只有几百个碱基对的寡核苷酸可制备浓度更高一些的琼脂糖凝胶。除能确定DNA片段的大小外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。实验内容：1. 用特定的引物通过PCR技术将鸡贫血病毒VP3基因扩增出来；2. DNA凝胶电泳检测PCR产物的大小；3. 纯化出PCR产物并用凝胶电泳检测纯化结果。实验步骤：
7、（一）PCRPCR反应五要素：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（含Mg2+)。1. 在0.2ml离心管中配制反应体系；下面是一个50l的PCR体系（供参考，可根据情况调整）：试 剂实验管(l)对照管(l)10Taq酶缓冲液55dNTP混合液(10 mM)11引物1 (10 nM)11引物2 (10 nM)11模板DNA1Taq DNA聚合酶(lU/l)11去离子水4041 有时候还需要加入MgCl2，但有的Buffer中已加入了MgCl2（如TaKaRa的Buffer），就不需要在PCR体系中加MgCl2了。2. 混匀每只PCR小管，然后短暂离心；3. 将PCR小管放到PCR仪器中，设定程序进
8、行扩增；下面是一个参考程序循环：(1) 预变性 94 2min(2) 变性94 30s (3) 退火6230s (4)延伸7245s（2）到 (4) 步骤循环30次(5) 终延伸 72 10分钟4. 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。（二）DNA凝胶电泳1.准备： 取有机玻璃胶槽，洗净、晾干、安装好（不同型号的电泳槽有不同的安装方法），水平放置，注意防止漏胶。将梳子插入到胶槽的定位槽中。2. 配置2% 琼脂糖凝胶板： 称取2g agarose（琼脂糖），置于250 ml 锥形瓶中，加入100 ml 1TAE（含GV 4 ug/ml），封口、加热使其全部溶解；3. 灌胶：将熔化的琼脂糖凝胶冷却至约65时,
9、小心地将凝胶倒入胶槽上，控制灌胶速度，使胶缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的凝胶层，凝胶厚度一般为0.30.5cm。4. 胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1TAE，淹没胶面，拔去梳子；5. 将5l PCR扩增产物样品与1l 6的上样缓冲液混合，加于加样孔中（注意：加样时应防止加样器头碰坏凝胶孔壁）；6. 电泳加样完毕后将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源， 80-100V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下观察或拍照。(三) PCR片段的纯化 (DNA纯化试剂盒)1 将PCR产物加入1.5ml的离心管中，并加入2倍体积的DNA Binding Buff
10、er，漩涡混匀；2 将混合物全部转入新的回收柱中（下面带套管），12000rpm离心1min；3 弃掉套管里面的液体，加入200l Wash Buffer于柱中，12000rpm离心1min；4 重复第三步；5 弃掉套管，将柱子套入一个新的1.5ml的离心管中，并向柱中加入30l Elution Buffer，12000rpm离心1min；6. 弃掉柱子，1.5ml离心管中的液体即为纯化好的PCR产物；7. 取2l PCR纯化样品，凝胶电泳检测纯化结果。实验准备：（一）主要试剂1.1TAE的配制：24.2g Tris、5.71ml冰乙酸、10ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)配制成
11、50TAE（100ml），然后稀释至1TAE。2.6上样缓冲液：0.5%溴酚蓝，0.5%二甲苯青，0.003M EDTA(pH 8.0),40%甘油。3PCR片段的纯化试剂盒。（二）主要仪器PCR仪、DNA电泳槽、电泳电源、离心机、照胶仪（观察DNA条带）注意事项：DNA荧光染料均是DNA诱变剂具有致癌能力,虽然Goldview比EB而言安全性上提高了很多，但在配制和使用时都应戴手套,并且不要把Goldview洒到桌面或地面上。思考题：1.PCR的原理？2.PCR失败的可能原因有哪些？3 琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？实验二、DNA限制性酶切反应、DNA酶切片段的回收与鉴定
12、实验原理：限制性内切酶识别短的DNA序列并在识别序列内或旁侧特异性切割双链DNA。对环状DNA有多少切口，就能产生多少个酶切片段。因此，在克隆重组质粒DNA时，人为在DNA片段两端加上两个特定的限制性内切酶位点（DNA片段中没有的位点），利用这两个酶分别切割DNA片段和载体，然后将DNA片段插入载体中构建成新的重组质粒。琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分
13、子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同，如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子（ocDNA）和线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时迁移速度顺序为：cccDNA IDNA ocDNA 。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）或GV染色，在紫外光下可以检出DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置，回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。实验内容：1 将上节课PCR得到的鸡贫血病毒VP3基因的 DNA片段，用DNA限制性内切酶Ba
14、mHI和SalI进行切割、纯化并用凝胶电泳检测纯化结果。2 将载体质粒用DNA限制性内切酶BamHI和Xho I进行切割，用DNA凝胶电泳对得到的DNA片段进行分离，切出含目的DNA片段的凝胶块，再将DNA从凝胶块中提取出来，DNA凝胶电泳检测DNA回收结果。实验步骤：1. 酶切反应：VP3-PCR产物(l)载体pGEX-1ZT(l)PCR产物250载体质粒02010X T Buffer5010X K Buffer05Bam HI1.51.5Sal I20Xho I02去离子水16.521.5总体积5050按上面的酶切体系分别在0.2ml PCR管中加入以上试剂，混匀，37放置1h。2载体质粒酶切片段的提取：2.1按实验一所述，配置2% 琼脂糖凝胶板。2.2将50l载体质粒酶切产物样品与10l6的上样缓冲液混合，加于加样孔中；2.3150V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下观察或拍照。2.4用一灭菌刀片，在紫外灯下，切下含目的DNA
