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1、细胞总RNA的提取操作步骤一、 准备 1、 物品:Trizol、氯仿(三氯甲烷)、异丙醇、75%灭酶异醇、冷PBS、1.5ml灭酶EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管2、 打开冷冻离心机4?预冷 二、操作步骤: 将Trizol、氯仿、冷PBS、EP管、灭酶枪头、一次性手套、EP管架、吸管等物品带入细胞室。 1、 取出EP管、做好标记 2、 取出细胞、收集上清保存备用 3、 用冷PBS冲洗细胞两次 4、 加入 1ml Trizol (24孔板每孔加0.5ml即可)，调小刻度用移液器吹打细胞至液体澄清(生化:摇动混匀后室温孵育10min) 5、 将裂解液转移至1.5ml灭酶EP管中，用黄枪
2、头加入氯仿0.2ml(1/5 Trizol体积)，用手剧烈震摇15秒，置室温5min(生化:3min dxyer:15min)，分层 6、 4?、12000g(12300rcf)离心15min，可见分层。 7、 用黄枪头小心收集上层水相约0.5ml置于另一1.5ml灭酶EP管中(确保不要吸入中间层和有机相)。 8、 各管分别加入0.5ml 异丙醇(等体积)，用力摇匀，置室温10min。(提前将异丙醇4?预冷，或混匀后置-20? 60min，提取效果更好) 9、 4?、 12000g离心10min，可见RNA沉淀。 10、倒弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的75%灭酶异醇1ml，用指轻弹管壁
3、使 RNA沉淀飘起 洗涤。 11、4?、7500g(7700rcf)离心5min，生化为10min，(亦有dxyer用 12000g)，沉淀即为总RNA。 12、弃上清，真空干燥约4min或空气中干燥510min，加入20l(30l)DEPC 水。 56?水浴小于10min助溶，取少量测OD值，其余-70?保存备 RNA制备的问题与解答 1、塑料制品、玻璃和金属物品的处理 (a)塑料制品:尽可能使用无菌，一次性塑料制品。已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理方法如下: (1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入
4、DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 (2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 (3)在通风柜中室温处理过夜。 (4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 (5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 (b)玻璃和金属物品 250?C烘烤3小时以上。 2、RNase 是RNA制备的杀手 RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅
5、速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取 RNase-free的物品时必须戴手套。 3、采用什么方式纯化总RNA, 答:我们提供多种RNA纯化方式，根据您对RNA纯化技术的熟悉程度，选用不同的纯化手段。从产品使用效果看，基于TriBlue的一步法分离总RNA试剂盒(K311,K321系列)无论是新手还熟手都可以得到比较理想的结果。
6、如果您对苯酚过敏，出于对环境的保护，您可以选用整个分离流程都不使用苯酚的试剂盒(K361系列)。从产品形式上，我们的总RNA分离分醇沉淀离心式和离心吸附柱方式两种。沉淀方式总的产量比较高，纯化规模机动，但是纯度不及吸附柱方式;吸附柱方式操作比较简单，纯度高，受吸附容量的影响，产量收到影响。 4、什么时候需要分离mRNA? 答:常规RT-PCR鉴定基因表达水平的，一般都可以采用总RNA作为RT-PCR 的模板，但是做cDNA文库，克隆丰度极低的基因，大多数DD-PCR， 削减杂交等需要纯化的mRNA。一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶连oligo (dT)，从组织或总RN
7、A种直接分离mRNA。 5、如何判定分离的总RNA的纯度, 答:需要从两个方面着手，缺一不可，特别是新手(1)测定OD260/OD280的比值，测定时，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀释。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。(2)琼脂糖变性电泳观察rRNA的完整性和强度。变性电泳需要采用MOPS系统，不可以采用DNA 电泳用的TBE或TAE系统。如果OD260/OD280过低(1.7)，通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。 6、什么时候需要加入RNA-Carrier? 答:样品很少或样品中RN
8、A含量低，制备RNA时需要加入一定的 RNA载体，以提高RNA纯化的得率。常用的载体有PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C和Glycogen。一定浓度范围的 Carrier对一些RNA的下游应用没有影响，如RT-PCR, Northern Blot。 7、如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNA? 答:无论用种方式制备的总RNA,要绝对保证不含基因组DNA是不现实的。如果您希望得到DNA free 的RNA样品，需要用RNase free的DNase I处理。 8、纯化的RNA样品如何保存, 答:如果希望得到最佳的结果，纯化的RNA需要立即用于下游实验。RNA可以
9、保存在-80C冰箱，长期保存可以置于液氮中。如果没有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在异丙醇或乙醇中，-20度保存。 9、组织和细胞样品如何收集，保存, 答:组织样品收集后，需要立即保存在液氮中，或在样品中加入一定量的保护剂，有一些商业化的产品可以选用。一般实验收集50-100mg组织就足够了。 10、如何估计RNA的产量, 答:能计算出RNA的产量，通常都是有比较多的起材料，但是很多情况下能够取得材料很少，所制备得到的RNA无法通过分光光度的方法测定含量和浓度。RNA的含量与组织和细胞的类型有比较大的关系, 同时与抽提的方式有关，例如用抽提小鼠组织100mg 肝可以得到500ug总RNA,
10、 100mg肺 得到200ug总RNA, 1百万个细胞Hela细胞可以得到15ug左右的总RNA. mRNA的含量一般占总RNA含量的2-5%。根据这样一些经验值，估算出您可能得到的量。样品如果低于20mg或10000个细胞，在抽提时需要考虑加入合适的RNA沉淀载体。 11、RNA制备过程中那个环节要特别注意, 答:一般情况下，细胞和组织在RNA抽提液中都可以保存一段时间，因为几乎所有的RNA的抽提裂解液中都含有高浓度的异硫氰酸胍等强变性剂, RNase基本是不起作用的，操作即使是粗放一些，也没有多达关系。但是通常是离心后取上清，这时候RNA已没有保护，操作要特别小心。 RNA抽提指南(TRI
11、ZOL) 注意事项: * 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 * 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A 或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可能富含RNA酶。 * 在TRIZOL 中，RNA 是隔离在RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150?C 的烘箱中烘烤4 小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中
12、浸泡10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 抽提步骤: 1(匀浆化作用 通过离心来沉淀细胞后，弃上清，用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，将匀浆样品在1530?C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。 67(每51010的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每110 细菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前应避免洗涤细胞因为那样会增加mRNA降解的可能性。) 2(分离阶段 每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15 秒并将其在30?C 下孵育23 分钟。在28?C 下以不超过12,000g 的离心力高速冷冻离心15 分
13、钟。离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的60% 3(RNA的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 mlTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。将混合的样品在1530?C 条件下孵育10 分钟并在28?C 下以不超过12,000g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。(如果希望分离DNA 和蛋白，有机层同样要予以保留。在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉
14、淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA 对于样品间标准化RNA 的产量十分有用。) 4(RNA的洗脱 移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次，每1 ml 的TRIZOL 至少加1 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在28?C 下以不超过7,500g的离心力高速冷冻离心5 分钟。 5(RNA的再溶解 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A 比值 1.6。用移液管尖分几次移260/280取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA，并在556
15、0?C下孵育10 分钟。 TMRevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 1. 冰上操作:在100l EP 管 (经DEPC 水处理过并消毒备用的)中加入 RNA ( ? ) 0.1-5g Oligo(dT) primer (0.5g/l) 1 l OR randon hexamer primer (0.2g/l) 1 l Deionized water TO 12 l 离心混匀 2(孵育: 70? 5min 0? 冰水浴立刻终止 离心 3(加冰上操作 5reaction buffer 4l TMRiboLock Ribonuclease inhibitor(20U/l) 1l dNTP mix (10M) 离心混匀 4(孵育: 37? 5min OR 25? 5min(IF random hexamer primer) 5. 逆转录:加RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/l)1l 6. 孵育: 42? 60min OR 25? 10min ?42? 60min(IF random hexamer primer) 7 .完成: 70? 10min 0? 立刻终止后将 cDNA 冻置-20? 或即刻PCR逆转录实验步骤 5. 完成: 95? 10min(破坏MLV) ?
