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1、1,第6章 色谱分离过程 Chromatography,6.1 概述6.2 色谱分离过程的基本原理6.3 色谱的分类6.4 色谱分离过程基础理论6.5 典型制备色谱工艺及应用,2,3,定义也称色谱层析、色谱、色层；样品中各组成依据其在固定相与流动相之间作用行为的差别进行多次分离的过程。发展史1903年一位俄国植物学家首次提出。1931年首次应用于制备；1938年适用范围扩展至无色物质；,6.1 概述,4,1903年俄国植物学家Tswett实验示意图,固定相CaCO3颗粒流动相石油醚,5,色谱法的特点,优点：“三高”、“一快”、“一广”,缺点：,高选择性可将性质相似的组分分开 高效能反复多次利用
2、组分性质的差异 产生很好分离效果 高灵敏度10-1110-13g，适于痕量分析 分析速度快几几十分钟完成分离 一次 可以测多种样品 应用范围广气体，液体、固体物质 化学、生化色谱分离、分析,对未知物分析的定性专属性差 需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS),6,6.2 色谱分离过程的基本原理,1.分离原理,色谱法之所以可以分离混合物，关键是它有一个高效的色谱柱。物质在柱内的分离过程，是物质在固定相和流动相之间发生吸附、脱附（或溶解、解析）的过程。被分离物按其溶解和解析的能力（或吸附和脱附的能力）的大小，以一定的比例分配在固定相和流动相之间。溶解（吸附）能力大的组分分配给固定相多一些，
3、分配给流动相少一些。这可用分配系数K表示。,7,分配系数的微小差异吸附能力的微小差异微小差异积累较大差异吸附能力弱的组分先流出； 吸附能力强的组分后流出,8,2.固定相（色谱柱填料）,硅胶衍生的固定相离子交换树脂大孔吸附树脂凝胶手性固定相,纤维素衍生物环糊精相聚（甲基）丙烯酰胺 -酸和 -碱固定相,9,3.色谱柱及柱技术,色谱柱装填方法色谱柱设计,高压匀浆填充干法填充径向压缩法轴向压缩法环形压缩技术,“饼式”柱面进样轴向流动,10,6.3 色谱的分类, 根据色谱法中两相的物理状态分：,根据固定相的形状分：,11,按分配原理分：,按分离的动力学过程分：,12,基本类型色谱法的分离机制,基本概念：
4、固定相（s）；流动相（m）,（一）吸附色谱法（二）分配色谱法（三）离子交换色谱法（四）空间排阻色谱法,13,（一）吸附色谱法,要求： 固定相吸附剂（硅胶或Al2O3） 具表面活性吸附中心分离机制：见图示,吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,14,分离机制： 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开,15,（二）分配色谱法,要求： 固定相机械吸附在惰性载体上的液体 流动相必须与固定相不为互溶 载体惰性，性质稳定， 不与固定相和流动相发生化学反应分离机制见图示,狭义分配系数,16,图示,分离机制 利用组分在流
5、动相和固定相间溶解度差别实现分离,连续萃取过程 back,17,（三）离子交换色谱法,要求： 固定相离子交换树脂流动相水为溶剂的缓冲溶液被分离组分离子型的有机物或无机物分离机制见图示,阳离子交换树脂 RSO3-H+ + X+ RSO3-X+ + H+,18,图示,分离机制： 依据被测组分与离子交换剂交换能力（亲和力） 不同而实现分离 back,19,（四）空间排阻色谱法,要求： 固定相多孔性凝胶 流动相水凝胶过滤色谱 流动相有机溶剂凝胶渗透色谱 分离机制见图示,20,图示,分离机制： 利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性 渗透实现分离 back,21,结论：,四种色谱的分离机制各不相同，
6、分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和渗透系数。,除了凝胶色谱法中的K仅与待测分子大小尺寸、凝胶孔径大小有关外，其他三种K值都受组分的性质、流动相的性质、固定相的性质以及柱温的影响。,22,亲和色谱（Affinity chromatography）,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,23,色谱图及有关术语 色谱图是以组分的响应信号（或浓度）为纵坐标，时间为横坐标的色谱流出曲线；它提供定性和定量分析的依据及色谱操作条件的有关信息。如下图：,24,(1)基线没有组分进入检测器时，检测器系统的噪声随时间变化的曲线通常为一条直线。当系统不稳定时，基
7、线会随时间而定向缓慢变化的现象，称为基线的漂移；当系统不稳定时，不同因素引起基线的起伏变化的现象，称为基线的噪声。(2)保留值是色谱法定性的依据。可以用组分在色谱柱中的滞留时间或使组分流出色谱柱所需要的流动相体积表示。死时间（tR0）-不与固定相发生作用的组分（空气或甲烷）流过色谱柱所需的时间。死时间正比于色谱柱中的空隙体积。,25,保留时间（tR）-组分流过色谱柱所需要的时间，一般指从进样到柱后组分浓度最大值时所需的时间。调整保留时间（tR）-扣除死时间后的保留时间 （tR=tR-tM）。用使组分流出色谱柱所需流动相体积表示时为：a死体积（Vm） VM=tMF0b保留体积（VR） VR=tR
8、F0c调整保留体积（VR） VR=tRF0=VR-VM,26,(3)峰高与峰面积 峰高是色谱峰的顶点到基线之间的垂直距离，用h表示；峰面积是色谱流出曲线与基线所围成的面积，用A表示。(4)区域宽度 是反映分离好坏的一个重要参数。一般，区域宽度越窄越好。可用三种方法表示：标准偏差（）：0.607倍峰高处峰宽的一半。峰底宽度（）：色谱峰两侧切线在基线上的截距 =4半峰宽度（ 1/2）：又称半宽度或区域宽度，峰高一半处的宽度。,27,28,1.根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含有组分的最少个数。 2.根据色谱峰的保留值可以进行定性分析。 3.根据色谱峰高或面积可以进行定量测定。 4.根据色谱峰间距
9、及其宽度，可对色谱柱的分离效能进行评价。 5.色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。,从色谱流出曲线可以获得许多重要信息：,29,6.4 色谱分离过程基础理论,1.保留值、分离度和柱效率,分配系数（K）：,K因物质不同而不同；K是温度的函数；是色谱分离的基础。K大的物质在柱内停留的时间长，反之则反。由于在柱中的多次平衡分配故K有微小差别的组分，在通过柱子后被扩大，从而被分离。,30,分配比（k）：又称容量因子。,K与k之比较：,式中，为相比，为柱中流动相体积与固定相体积之比。它反映了柱型的特点：填充柱=635；毛细管柱=50-1500。,31,K和k与物质及两相的性质有关；K 与k都是温
10、度、压力的函数；K与两相的体积无关；k与两相的体积有关，即与相比有关；K与k是衡量色谱柱对组分保留能力的参数；K与k值越大，保留时间越长；,32,分离度：相邻色谱峰峰顶之间的距离除以此两色谱峰的平均宽度。,33,柱效率：,34,2.色谱理论模型,色谱分离过程涉及到两个方面：其一是色谱分离与物质在两相中的分配系数有关这由物质（包括组分、流动相、固定相）的分子结构和性质决定这也就决定了各组分在柱后的出峰时间，即色谱过程中的热力学因素；其二是色谱分离与物质在柱内的运动情况有关这由物质在流动相和固定相间的传质阻力决定这也就决定了各组分色谱峰的形状和区域宽度，即色谱过程的动力学因素。,35,色谱理论包括
11、两方面:热力学理论：研究分配(分离)过程，塔板理论（plate theory）。动力学理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（rate theory）。,36,塔板理论 (the plate model),1941年，Martin和Synge阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；与精馏相似，色谱分离也是一个分配平衡过程。这就是Martin等人提出的塔板理论。,37,塔板理论基本假设,色谱柱由一系列塔板组成 塔板内，组分在两相间迅速达到平衡（理想色谱） 组分的分配系数不随它的浓度变化而变化（线性分布等温线） 组分的轴向扩散为零 流动相的流动
12、是跳跃过程,38,39,H=L/N,塔板理论方程：,若扣除死时间（体积）的影响，得到有效塔板数（n）和有效塔板高度(H)：,H=L/N,40,它们比理论塔板数及高度，能更有效地反映色谱分离好坏与塔板数和塔板高度之间的对应关系。一般说来，色谱柱的理论塔板数越大，表示组分在色谱柱中达到分配平衡的次数越多，越有利于分离，但不能说明组分间分离的好坏，因为分离好坏决定于各组分在流动相和固定相之间分配系数的差别，而不是分配次数的多少。,41,无论是有效还是理论塔板数不能作为实际分离可能的依据。另一方面，塔板理论中有很多不合实际的假设，如：假定无纵向扩散、分配系数与浓度无关；再者，塔板理论不能解释塔板高度是
13、受哪些因素的影响及流动相不同流速下测得的理论塔板数不同的事实。因而它有一定的局限性。,42,2速率理论1956年由荷兰学者范弟姆特把影响塔板高度的动力学因素与塔板理论结合起来，导出了塔板高度与流动相线速关系的方程。认为色谱峰的总扩张等于各独立因素对扩张影响之和；色谱柱的总板高等于各独立因素对板高贡献之和。即,式中A、B、C为常数，A为涡流扩散项，B为分子扩散项系数，C为传质阻力项系数。,43,（1）涡流扩散项在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称涡流扩散。填充柱的多孔性，引起的多径性与填充物
14、的颗粒直径dp（cm）的大小和填充不均匀性有关。颗粒越大、填充越不均匀，涡流扩散就越严重，使板高增大。,44,（2）分子扩散项（又称纵向扩散项）B/u 组分在固定相和流动相中的浓差分子扩散。流动相的线速在分子扩散项中使板高减小，但分子扩散项系数使板高增大。表明B与组分在流动相的扩散系数和弯曲因子有关。流动相的粘度和相对分子量越小，组分在其中的扩散系数越大；温度越高扩散系数越大。弯曲因子与填充物有关，填充物的存在使分子自由扩散的能力降低；填充物填充的均匀性对弯曲因子影响不是主要的，只要有填充物存在，影响流动相路径弯曲的因素和减小分子扩散的因素就存在。,45,（3）传质阻力项Cu组分在固定相和流动
15、相中移动的速率，包括：流动相和固定相传质阻力即两相对组分分子运动能力的影响。若传质阻力大，就会引起组分分子的超前和滞后，从而引起色谱峰的扩张。对气相色谱的填充柱而言，有：,流动相传质阻力系数,固定相传质阻力系数,46,范底姆特方程：,该方程为气相色谱的板高载气线速方程，对分离条件的选择具有很好的指导作用，它说明了固定相粒度、填充均匀性、流动相种类及流速、柱温、固定相的特性等对柱效及峰扩张的影响。由此方程得到板高对线速的曲线。,47,6.5 典型制备色谱工艺及应用,1.模拟移动床色谱（SMBC）,模拟移动床色谱技术，是模拟移动床技术与色谱分离技术的组合，是连续色谱的一种，属吸附分离技术。它是一系列色谱柱的串联，通过进样口与出样口定期变更，模仿填料的逆流，故称模拟移动床色谱。,
