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1、第八篇 遗传信息的贮存和表达（第三十二四十三章 小结）第三十二章 DNA 复制DNA 复制是以 DNA 为模板合成相同 DNA 分子的过程，其主要特征有：需要模板、四种 dNTP 和 Mg2 ；被复制的区域必须进行解链；半保留复制；需要引物，作为引物的主要是短的 RNA，少数是蛋白质；复制的方向始终是 53；具有固定的起点；多为双向复制；半不连续性；高度有序、高度进行和高度忠实。参与 DNA 复制的主要酶和蛋白质有 DNA 聚合酶、解链酶、SSB、引发酶、拓扑异构酶、连接酶和端聚酶等。DNA 聚合酶是参与 DNA 复制的主要酶。大肠杆菌细胞中有 DNA 聚合酶、和。大肠杆菌的 DNA 聚合酶也
2、称为 Kornberg 酶，是一种多功能酶，具有 53的聚合酶活性、53和 35的外切核酸酶活性。使用特殊的蛋白酶处理聚合酶得到的大片段称为 Klenow 酶，具有 35外切酶和 53聚合酶活性，Klenow 酶的手指-拇指-掌心三维结构模式出现在许多具聚合酶上。聚合酶也具有 35外切酶活性，但无 53外切酶活性，参与 DNA 的修复。聚合酶由多个亚基组成，虽然也具有 53聚合酶活性和 35外切酶活性，但却分属不同的亚基。该酶是参与大肠杆菌染色体 DNA 复制的主要酶。完整的聚合酶由核心酶、滑动钳和钳载复合物组成。在 DNA 复制过程中，滑动钳松散地夹住 DNA 模板，并能自由地向前滑动，大大
3、提高了酶的进行性。DNA 聚合酶和属于易错的 DNA 聚合酶，参与 DNA 的修复合成。真核细胞中至少有 15 种以上的 DNA 聚合酶，除了 5 种发现较早的聚合酶 、 、 、 和 以外，还发现了聚合酶 、 、 、 、 、 、 、 和 等。这些新发现的聚合酶主要参与 DNA 的跨越合成。 、 、 和 具有 3 - 外切酶活性。DNA 解链酶是一类催化 DNA 双螺旋解链的酶，它除了能够结合 DNA 以外，还能够结合 NTP 并同时具有依赖于 DNA 的 NTP 酶活性。SSB 是一种专门与 DNA 单链区域结合的蛋白质，无任何酶的活性。DNA 拓扑异构酶是一类通过催化 DNA 链的断裂、旋转
4、和重新连接而直接改变 DNA 拓扑学性质的酶。拓扑异构酶被分型和型。型在作用过程中，只能切开 DNA 的一条链，而型在作用过程中同时交错切开 DNA 的两条链。参与 DNA 复制的是型。所有拓扑异构酶的作用都是通过两次转酯反应来完成的。DNA 引发酶是一种特殊的 RNA 聚合酶，用来合成 RNA 引物。原核细胞内切除 RNA 的酶是 DNA 聚合酶或核糖核酸酶 H。真核细胞内负责切除RNA 引物的酶核糖核酸酶 H/FEN1 或 FEN1/Dna2。DNA 连接酶是一类催化一个双螺旋 DNA 内相邻核苷酸 3 - 羟基和 5 - 磷酸甚至两个双螺旋 DNA 两端的 3 - 羟基和 5 - 磷酸发
5、生连接反应形成 3，5 - 磷酸二酯键的酶。DNA 连接酶在催化连接反应时需消耗能量。有的连接酶使用 NAD +，有的使用 ATP。尿嘧啶 DNA 糖苷酶是一种专门用来切除出现在 DNA 链上非正常 U 的水解酶。端聚酶由蛋白质和 RNA 组成，其中 RNA 部分序列充当模板，蛋白质具有反转录酶的活性，它所起的作用是复制端粒 DNA，维持染色体端粒结构的完整。所有的 DNA 复制都可以分为起始、延伸、终止和分离三个阶段。复制是以复制子为单位进行的。任何一个复制子都含有一个复制起始区。不同基因组 DNA 具有不同的复制子结构，像细菌染色体、质粒、噬菌体、病毒和线粒体基因组 DNA 都只有一个复制
6、子，而真核细胞内的每一个染色体 DNA 都含有多个复制子。大肠杆菌染色体 DNA 的复制为 复制，起始阶段最重要的事件是对其复制起始区oriC 的识别，直到形成引发体。在此阶段涉及DnaA、DnaC、DnaT、DnaB、PriA、PriB、PriC 和 DnaG 蛋白，它们按照一定的次序在oriC 结合或解离，相互间具有招募作用。复制的延伸首先是复制体的形成，这需要聚合酶全酶加入到引发体。一个双向复制的复制子有两个复制体。在每一个复制体上，同时进行前导链和后随链的合成。在一个复制叉内的聚合酶全酶同时催化前导链和后随链的合成，这是因为后随链的模板在复制中形成突环结构。复制结束于终止区，需要 Tu
7、s 蛋白的帮助。最后的两个子代 DNA 分子的分离需要拓扑异构酶。某些噬菌体 DNA 和一些小的质粒在宿主细胞内以滚环复制方式扩增 DNA，此外，真核细胞染色体 DNA 的局部扩增也可以通过这种方式进行；线粒体 DNA、叶绿体 DNA 和少数病毒以 D-环的方式进行复制。真核细胞的细胞核 DNA 复制与原核细胞的染色体 DNA 复制不完全相同。参与细胞核 DNA 正常复制的聚合酶是 、 和 。前导链和后随链的合成都经历了从 DNA 聚合酶 /引发酶复合物到 PCNA/DNA 聚合酶 的转换；FEN-1/RNaseH负责切除 RNA 引物，DNA 连接酶负责连接相邻的冈崎片段，拓扑异构酶负责清除
8、复制叉移动中形成的正超螺旋，拓扑异构酶a 和b 则负责将最后的 2 个以共价键相连的连环体 DNA 分开。解决线形 DNA 末端复制难题的机制有：使用端聚酶、经重组形成串联体、将线形DNA 暂时转变为环形 DNA、滚环复制以及使用蛋白质-dNTP 作为引物。DNA 复制的调控主要在起始阶段，原核细胞利用甲基化来调控，真核细胞内存在两种机制控制 DNA 复制的启动，一种是由执照因子控制的正调控，另一种是由增殖蛋白控制的负调控。第三十三章 DNA 损伤、修复和突变DNA 是唯一的一种损伤后可被完全修复的分子，而其他生物大分子在受到损伤以后被降解或被取代。导致 DNA 损伤的根源有细胞内在的因素和环
9、境中的因素。属于细胞内在因素的有DNA 复制过程中发生的错误、DNA 结构本身的不稳定、细胞内活性氧的破坏作用。属于环境因素的有物理因素和化学因素，前者包括紫外辐射和离子辐射，后者包括各种化学诱变剂。DNA 损伤分为碱基损伤和 DNA 链的损伤。碱基损伤包括碱基脱落、碱基转换、碱基修饰、碱基交联和碱基错配。DNA 链的损伤包括 DNA 链的断裂、DNA 链的交联和 DNA 与蛋白质之间的交联。DNA 修复可分为直接修复、切除修复、易错修复和重组修复等。直接修复是直接将受到损伤的碱基逆转为正常的碱基，而不需要将它切除。能够被这种机制修复的损伤有嘧啶二聚体和 6- 烷基鸟嘌呤。细胞内连接酶将断裂的
10、 DNA 链重新缝合的修复也属于直接修复。参与嘧啶二聚体直接修复的酶为 DNA 光裂合酶，此酶能够直接识别和结合 DNA 上的嘧啶二聚体，利用吸光色素捕捉到的光能将嘧啶二聚体打开，最后再与 DNA 解离。催化烷基化碱基直接修复的酶是烷基转移酶，该酶以“自杀”的方式参与反应。切除修复就是先切除损伤的碱基或核苷酸，然后以另外一条链上正确的核苷酸为模板，重新合成正常的核苷酸。整个切除修复过程包括识别、切除、重新合成和重新连接。切除修复又分为 BER 和 NER，前者直接识别具体的受损伤的碱基，而后者识别损伤对 DNA 双螺旋结构造成的扭曲。BER 最初的切点一般是 N-糖苷键，首先切除的受损伤的碱基
11、，由 DNA 糖苷酶催化，DNA 糖苷酶作用后在 DNA 分子上留下 AP 位点，被细胞内的 AP 内切酶识别后切除。随后的修补合成有短修补和长修补两种途径，其中短修补是主要途径。对于 DNA 的自发脱碱基作用产生的损伤也通过 BER。NER 最初的切点是损伤部位附近的 3，5 - 磷酸二酯键，损伤以寡聚核苷酸的形式被切除。整个修复过程在原核细胞和真核细胞中是非常相似的，共包括 5 步：识别损伤、特殊的内切酶在损伤部位的两侧切开 DNA 链、去除切口之间的带有损伤的 DNA 片段、聚合酶填补缺口、连接酶重新缝合切口。NER 分为全局性基因组 NER 和 TCR，前者负责修复整个基因组的损伤，速
12、度慢、效率低；后者专门负责修复那些正在转录的基因在模板链上的损伤，速度快、效率高。两类 NER 的主要差别在于识别损伤的机制，TCR 识别损伤的是 RNA 聚合酶，当它转录到受损伤部位而前进受阻的时候，TCR 即被启动。MMR 实际上是一种特殊的核苷酸切除修复，主要用来修复 DNA 分子上错配的碱基，也能修复一些因“复制打滑”而诱发的核苷酸插入或缺失。大肠杆菌的 MMR 系统为甲基化导向的错配修复，它利用甲基化来区分子链和母链的。DNA 双链断裂修复机制一是精确性较高的同源重组，二是非同源末端连接。非同源末端连接是人类修复双链断裂的主要方式，需要 Ku70 与 Ku80 蛋白、Artemis、
13、DNA-PKCS和 DNA 连接酶以及 XRCC4，这种方式容易发生错误。损伤跨越仅仅是整个细胞面对 DNA 损伤做出的一种反应，损伤并没有真正消失。反应的目的是为了维持复制的连续性，克服损伤对复制的阻碍。反应的手段一是通过重组，第二种是所谓的“跨越合成术”。重组跨越使用同源重组的方法将 DNA 模板进行交换以避免损伤对复制的抑制；跨越合成由专门的一般无校对能力的 DNA 聚合酶与取代停留在损伤位点上原来的催化复制的聚合酶，在子链上随意插入核苷酸结果导致对损伤位点的跨越。发生在 DNA 分子上可遗传的结构变化通称为突变。突变可分为点突变和移码突变。点突变是指 DNA 分子某一位点上所发生的一种
14、碱基对变成另外一种碱基对的突变，有转换和颠换两种形式。其后果取决于突变位置和具体的变换方式。根据突变的后果，发生在蛋白质基因编码区的点突变可分为沉默突变、错义突变、无义突变和通读突变。移码突变是指在一个蛋白质基因的编码区发生的一个或多个核苷酸的缺失或插入，其危害性最大。突变的原因有内外两种元素。由内在因素引起的突变被称为自发性突变，由外在因素引发的突变被称为诱发突变。自发突变有自发点突变和自发移码突变。自发移码突变的主要原因有“复制打滑”和转座作用。诱发突变也有诱发点突变和诱发移码突变。能够诱发点突变的试剂有碱基类似物、烷基化试剂、脱氨基试剂和羟胺。诱发移码突变的主要是嵌入试剂，它们都是一类扁
15、平的多环分子，能插入到 DNA 分子上的碱基之间。DNA 突变并不是不可逆转的，如果在老的突变位点上发生第二次突变，致使原来的表现型得到恢复，这样的突变被称为回复突变。抑制突变有时被称为假回复突变，它是指发生在非起始突变位点上但能够掩盖或抵消起始突变的第二次突变，它分为基因内校正和基因间校正。基因内校正与起始突变发生在相同的基因内。基因间校正发生在与第一次突变不同的基因上，绝大多数是在翻译的水平上起作用。真核细胞内的 DNA 损伤能激活损伤监察机制或者激活细胞凋亡机制。从损伤发生到最后的反应出现前后经历了 DNA 损伤损伤探测信号转导反应等四个阶段。损伤探测由一系列专门的损伤探测蛋白组成。第三
16、十四章 DNA 重组DNA 重组是指发生在 DNA 分子内或 DNA 分子之间核苷酸序列的交换、重排和转移现象，主要包括同源重组、位点特异性重组和转座重组。同源重组是两个 DNA 分子的同源序列直接进行交换。细菌的接合、转导、转化和真核细胞的同源染色体之间的交换等都属于同源重组。解释同源重组的模型有Holliday 模型、Aviemore 模型（单链断裂模型）和双链断裂模型。三种模型在重组过程中形成 状的 Holliday 结构是一致的。同源重组的基本步骤包括：链断裂与切除、链侵入、退火与合成、形成 Holliday 结构、Holliday 结构的分离和交换。重组是在特定的蛋白质和酶的协助下完成的。参与大肠杆菌同源重组有关的蛋白质包括：RecA 蛋白、RecBCD 蛋
